Лабораторная работа №3 выращивание стерильных проростков

Цель работы. Выращивание стерильных проростков гороха, сои с целью получения асептических растений и получения эксплантов in vitro

Теоретическое обоснование. Стерильные проростки выращивают с целью получения асептических растений и получения эксплантов in vitro. В зависимости от задачи опыта семена высевают на воду или агаризованную питательную среду.

Существуют три возможных пути использования стерильных проростков: 1) для получения эксплантов из дифференцированных тканей, которые при переносе на питательную среду, содержащую фитогормоны, дифференцируются и в результате интенсивной пролиферации образуют каллусную ткань; 2) для получения каллуса непосредственно на проростках; 3) для получения протопластов из частей проростка, обычно из листьев, иногда из корней.

Для образования каллуса на проростках необходимы фитогормоны, поэтому в состав питательной среды для выращивания входит 2,4-Д.

Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Семена (горох, соя). Диацид, 96%-ный спирт, стерильные химические стаканы, стерильная вода.

Стерильные чашки Петри, пробирки, пинцет, стерильные марлевые мешочки.

Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Отобрать здоровые ровные семена гороха или сои, тщательно промыть их в мыльном растворе, затем водопроводной и дистиллированной водой. Промытые семена в марлевых мешочках погрузить на 2-5 мин в 96%-ный спирт, промыть в стерильной воде и поместить в раствор диацида на 20 мин. Затем пятикратно ополоснуть семена в стерильной воде.

Работу проводят в ламинар-боксе. С помощью стерильного пинцета разложить по 5-10 семян в стерильные чашки Петри или пробирки с питательной средой. Чашки Петри с семенами помещают в термокомнату при температуре +25^оС. Асептические проростки можно использовать для получения эксплантов через 8-15 дней.

Для проращивания семян можно использовать среды Уайта (табл.1), Мурасиге и Скуга (МС) (лаб.раб 2) или Гамборга (В-5) (табл. 2), но без добавок фитогормонов.

Требования к отчету по лабораторной работы

Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.

Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками

Контрольные вопросы.

1. С какой целью выращивают стерильные проростки?

2. Каковы возможные пути использования стерильных проростков?

3. Какие среды используют для выращивания стерильных проростков?

Литература

1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.

2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.

3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.

3. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.

4. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

5. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.

Приложение.

Таблица 1. Среда Уайта, рН 5,6-5,8

Компоненты	Содержание, мг/л	Компоненты	Содержание, мг/л
Ca(NO3)2	200	CuSO4.5H2O	0,02
MgSO4	360	ZnSO4	1,5
Na2SO4	200	Na2MoO4.2H2O	0,0025
KNO3	80	Kl	0,75
KCl	65	Пиридоксин-HCl	0,1
NaH2PO4	16,5	Тиамин-HCl	0,1
H3BO3	1,5	Никотиновая кислота	0,5
MnSO4	4,5	Глицин	3,0
Fe(SO4)3	2,5	Сахароза	20.000

Таблица 2. Среда Гамборга (В-5), рН 5,8

Компоненты	Содержание, мг/л	Компоненты	Содержание, мг/л
NaH2PO4.H2O	150	ЭДТА-Na2.2H2O	37,3
KNO3	2500	Na2MoO4.2H20	0,25
(NH4)2SO4	134	Kl	0,75
MgSO4.7H2O	250	FeSO4.7H2O	28,0
CaCl2.2H2O	150	Тиамин- HCl	10,0
H3BO3	3,0	Пиридоксин- HCl	1,0
MnSO4.7H2O	10,60	Никотиновая кислота	1,0
CoCl2.6H2O	0,025	Мезо - инозит	100
CuSO4.5H2O	0,025	2,4-Д	2,0
ZnSO4.7H2O	2,0	Сахароза	20.000