Среда Мурасиге и Скуга для микроразмножения картофеля

черенкованием побегов, рН 5,8

Компоненты	Содержание, мг/л
Минеральные элементы	По Мурасиге-Скугу
Гибберелловая кислота	2,0
Кинетин	0,5
Аденин	40,0
Никотиновая кислота	2,0
Пиридоксин	1,0
Тиамин	1,0
Пантеонат кальция	10,0
Активированный уголь	10000
Сахароза	30000
Агар	7000

Лабораторная работа № 6

ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ ЗЕМЛЯНИКИ.

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ЗЕМЛЯНИКИ.

Цель работы. Выделение апикальных меристем земляники, их культивирование на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга с целью получения стерильных почек.

Теоретическое обоснование. При культивировании апикальных меристем земляники на питательной среде с высоким содержанием кинетина (0,5-1 мг/л) под действием этого гормона происходит подавление апикального доминирования верхушечной меристемы и активация пазушных меристем. В результате примерно через две недели после помещения изолированной верхушки, состоящей из меристематического купола и одного-двух листовых примордиев, на питательную среду, основания развертывающихся листьев начинают зеленеть, увеличиваются в объеме, и вскоре из пазух показываются пучки листьев. В пазухе новых листьев опять закладываются почки, прорастающие через некоторое время. Через один-два месяца экспланты превращаются в конгломерат множества разновозрастных и разновеликих почек с развернутыми листьями. Образовавшиеся почки легко отделяются одна от другой. После пересадки на свежую питательную среду каждая из них формирует новые пазушные почки, увеличивая тем самым число точек роста, но не образует корней. Для корнеобразования почки должны быть пересажены на среду, содержащую ауксин.

Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Столоны земляники. Пробирки со стерильной питательной средой (табл.1), 96%-ный спирт, 0,1%-ный водный раствор сулемы или диацида, в колбе на 1 л стерильная вода.

Стерильные чашки Петри, стерильные скальпели, стерильные иглы, бинокулярная лупа, стерильные предметные стекла, спиртовая горелка, спички, марлевые мешочки, стерильные химические стаканы.

Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Столоны земляники промывают в мыльной воде и ополаскивают чистой водой. Выделяют скальпелем пазушные почки, находящиеся у основания листьев столонов земляники. Эту операцию проделывают вне ламинар-бокса. Всю дальнейшую работу необходимо проводить в ламинар-боксе. Почки собирают в марлевый мешочек и погружают для стерилизации в раствор диацида на 10 мин. Вынимают мешочек за нитку из раствора диацида и пять раз промывают в стерильной дистиллированной воде. Необязательно иметь для этого пять-шесть стаканов со стерильной водой, так как они занимают много места в ламинаре. Достаточно двух стаканов, на ¼ объема наполненных стерильной водой. Последовательно погружают в стаканы мешочек с почками, прополаскивают в воде в течение нескольких минут. Затем воду из второго стакана сливают в первый, а во второй наливают стерильную воду из колбы и прополаскивают в ней мешочек с почками. Так же поступают и в дальнейшем. Стерильные почки переносят из мешочка в чашку Петри и используют для вычленения меристем. Эту операцию проводят под бинокулярной лупой при десятикратном увеличении. На предметном стекле почку с помощью препаровальной иглы и скальпеля освобождают от многочисленных листовых чешуек; затем, придерживая почку иглой, скальпелем вычленяют меристематический купол с одним-двумя листовыми примордиями.

Вычлененную в ламинар-боксе меристему переносят на скальпеле в пробирку с питательной средой (табл.1). Пробирки закрывают целлофаном и помещают в световую климатическую камеру при температуре +25^оС. Через четыре недели отмечают число образовавшихся почек и используют их для выполнения следующей работы.

Требования к отчету по лабораторной работы

Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.

Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Контрольные вопросы.

1.Каким образом высокое содержание кинетина в среде влияет на процесс культивирования земляники?

2.Каким способом можно индуцировать корнеобразование при микроразмножении земляники?

3.В каких растворах и с какой целью промывают марлевые мешочки с почками?

Литература

1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.

2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.

3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.

3. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.

4. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

5. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.

Приложение.

Таблица 1. Модифицированная питательная среда Мурасиге и Скуга для культивирования апикальных меристем земляники,рН 5,8

Компоненты	Содержание, мг/л	Компоненты	Содержание, мг/л
Минеральные элементы	По Мурасиге-Скугу	Никотиновая кислота	0,5
Хелат железа	5,0	6-БАП	0,5
Аскорбиновая кислота	1,0	Глюкоза	20.000
Тиамин	0,5	Агар-агар	7000
		Пиридоксин	0,5

Лабораторная работа №7

ИНДУКЦИЯ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ

ПРИ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ

НА ПРИМЕРЕ ЗЕМЛЯНИКИ.

Цель работы. Укоренение почек земляники, полученных при микроклональном размножении, на питательной среде, содержащей ауксины.

Теоретическое обоснование. При культивировании апикальных меристем земляники на питательной среде, содержащей цитокинин (6-БАП), в результате активации пазушных меристем из одной верхушечной меристемы образуется много стеблевых почек, точки роста вытягиваются, разворачиваются новые листья. Однако укоренения образовавшихся почек на этой среде не происходит. Для укоренения образовавшихся при микроклональном размножении земляники почек их необходимо пересадить на новую питательную среду, содержащую ауксины.

Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Пробирки с конгломератами почек земляники на питательной среде, пробирки со стерильной питательной средой (табл.1). Стерильный пинцет, стерильный скальпель, стерильная чашка Петри, спиртовая горелка, 96%-ный спирт, спички, стакан со стерильной водой.

Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Используют культуру апикальных меристем земляники в возрасте трех-четырех недель после начала культивирования. В стерильных условиях извлекают из пробирки конгломерат почек земляники. Освобождают основание конгломерата от остатков агаризованной питательной среды, промывают его в стерильной воде и переносят в стерильную чашку Петри. Разъединяют с помощью скальпеля конгломерат на отдельные почки и каждую из них переносят пинцетом в пробирки с питательной средой для укоренения (табл. 2). Обжигают горлышко пробирки и пробку, закрывают пробкой, оборачивают целлофаном и помещают пробирки в световую камеру с освещенностью 10 000 люкс, температурой +26^оС и влажностью 60%.

Через месяц после пересадки почек на среду для корнеобразования проростки можно переводить в нестерильные условия. Обычно растения пересаживают в ящики или горшки, наполненные смесью торфа и песка (3:1), первое время накрывают колпаком из полиэтилена.

Требования к отчету по лабораторной работы

Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.

Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Контрольные вопросы

1.Каким способом можно индуцировать корнеобразование при микроразмножении земляники?

2. Что происходит при культивировании апикальных меристем земляники на питательной среде, содержащей цитокинин?

3.При каких условиях проводят корнеобразование проростков при микроклональном размножении земляники?

Литература

1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.

2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.

3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.

3. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.

4. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

5. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.

Приложение.

Таблица 1. Питательная среда для корнеобр