Гель-електрофорезу:

А – нанесення зразків у гель;

Б – камера для електрофорезу;

В – електрофореграма білків

Методом електрофорезу можна розділити білки за молекулярною масою. Для цього використовують електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) за наявності додецилсульфату натрію (ДДС-Na). ДДС-Na є дифільною речовиною та містить заряджену й гідрофобну групи. Білки зв’язуються з ДДС-Na своїми гідрофобними радикалами й при цьому денатурують. Таким чином, білки вирівнюються за формою та зарядом. Після цього рухливість білка при електрофорезі залежить тільки від його молекулярної маси.

Додецилсульфат натрію (ДДС-Na)

У випадку використання імунологічних методів для виявлення розділених білків говорять про імуноелектрофорез. На першому етапі проводять електрофоретичне розділення білків у поліакриламідному гелі, після чого білки переносять із гелю на мікропористу нітроцелюлозну мембрану та детектують заданий білок із використанням специфічних до нього антитіл.

Ізоелектричне фокусування. Це один із найефективніших і найпоширеніших методів фракціонування та очищення білків. Цей метод дозволяє розділити білки, що відрізняються за ізоелектричною точкою тільки на 0,01. Суміш білків, які піддають розділенню, вносять у колонку або наносять на пластину, заповнену електропровідною рідиною. Розділення білків відбувається залежно від їх заряду в градієнті pH, що створюється за допомогою синтетичних сумішей поліамінополікарбонових кислот (амфолітів) під дією електричного поля. Проводять спочатку електрофорез у горизонтальному напрямі. Білки розділяються залежно від величини заряду (рух білка припиняється, коли значення рН дорівнює ізоелектричній точці для даного білка). Потім обробляють пластину розчином ДДС-Na і проводять електрофорез у вертикальному напрямі. Тепер білки розділяються залежно від молекулярної маси. Виявлення білків після їх розділення ізоелектричним фокусуванням проводять тими самими методами, що використовують після звичайного гель-електрофорезу, – забарвленням спеціальними барвниками з урахуванням того, що амфоліти здатні утворювати з ними комплекси.

8.2.5. Розділення білків за здатністю до специфічних взаємодій. Афінна хроматографія. Метод базується на здатності білків міцно зв’язуватися з різними молекулами, але нековалентними зв’язками. Використовується для виділення й очищення ферментів, імуноглобулінів, рецепторних білків.

Молекули речовин (ліганди), з якими специфічно зв’язуються певні білки, ковалентно сполучають з інертним полімером (рисунок 9 (А)). При пропусканні розчину білків через колонку з полімером на колонці адсорбується лише специфічний для даного ліганду білок за рахунок комплементарного зв’язування білка з лігандом. Решта білків вільно виходять із колонки разом із розчинником (рисунок 9 (Б)). Затриманий білок потім можна вимити з колонки за допомогою буферного розчину, що містить у високій концентрації вільний ліганд (рисунок 9 (В, Г)). Часто використовують вільний ліганд, що має вищу спорідненість до білка, ніж у фіксованого на полімері ліганду.

Цей високочутливий метод дозволяє виділити в чистому вигляді дуже малі кількості білка з клітинного екстракту, що містить сотні інших білків. Одним із варіантів цього методу є імуноафінна хроматографія: до частинок полімеру приєднуть антитіла до певного білка, що забезпечує з дуже високою специфічністю затримку на колонці цього білка.

Рисунок – Схема розділення білків методом афінної хроматографії