8. Методи дослідження білків
8.1. Методи виділення білків із біооб’єктів
Виділення білка з біологічного матеріалу ґрунтується на його фізико-хімічних властивостях. Найчастіше для цих цілей використовують кислотно-основні властивості білків (амфотерність, заряд молекули, ізоелектричний стан).
Від заряду білкових молекул залежить їх:
розчинність (мінімальна в ІЕТ);
електрофоретична рухливість;
структура і біологічна активність.
При розчиненні у водному середовищі на поверхні білкової молекули формується гідратна оболонка.
Стійкість білка в розчині залежить від:
1) заряду білкової молекули;
2) наявності гідратної оболонки;
3) молекулярної маси білка.
Для виділення нативних білків (без зміни просторової структури) із біологічного розчину використовують методи:
висолювання – осадження білків солями лужних і лужноземельних металів ((NH4)2SO4, NH4Cl, KCl, NaCl, Na2SO4, MgSO4 та ін.). Висолювання зумовлюється дегідратацією макромолекул білка з одночасною нейтралізацією зарядів протилежно зарядженими іонами солі. Різні білки висолюються при різному насиченні нейтральними солями і різних значеннях рН розчину, що залежить від різниці в молекулярній масі, міри дисперсності білка, іонної сили осаджувача. Білки з найменшою розчинністю випадають в осад при невеликих концентраціях солей. При цьому первинна структура білка не порушується. Це грубий метод розділення білків на групи. Так, глобуліни, які мають більшу молекулярну масу порівняно з альбумінами, випадають в осад при напівнасиченні, а альбуміни – при повному насиченні розчину сульфатом амонію;
органічні розчинники при низьких температурах використовуються для щадного групового розділення білків. Так, за методом Кона фракціонують білки плазми крові спиртом: альбумін – спирт 40 %, рН 4,8, 1-5 °С; α1-глобуліни – спирт 18 %, рН 5,2, 1-5 °С; α2-глобуліни – спирт 40 %, рН 5,8, 1-5 °С; β, γ-глобуліни – спирт 25 %, рН 6,9, 1-5 °С; фібриноген – спирт 8 %, рН 7,2, 1-3 °С.
При використанні цих методів білки позбавляються гідратної оболонки і випадають в осад.
8.2. Методи фракціонування білків
8.2.1. Відділення білків від низькомолекулярних домішок Діаліз (метод мембранних сит) базується на нездатності білків проходити через напівпроникну мембрану на відміну від низькомолекулярних речовин. Використовують діалізну мембрану, яка є полімером і має пори певної величини. Малі молекули (низькомолекулярні домішки) проходять через пори в мембрані, а крупні (білки) затримуються. Таким чином білки відмивають від низькомолекулярних домішок, наприклад, від солей після висолювання.
8.2.2. Розділення білків за молекулярною масою. Гель-фільтрація (гель-хроматографія). Гель-фільтрацію проводять на хроматографічних колонках, заповнених гранулами набряклого гелю (сефадекс), який являє собою полісахаридні ланцюги декстрану та має пори певного діаметра. Залежно від розмірів пор випускають ряд марок сефадексів: G-200, G-100, G-75 та ін. У колонку вносять суміш білків. Швидкість проходження білків через колонку, заповнену сефадексом, буде залежати від їхньої молекулярної маси: чим менша маса молекул білка, тим легше вони проникають всередину гранул сефадексу й довше там затримуються. Білки ж із більшою молекулярною масою не проникають через пори у гранули гелю, а тому вони швидше виходять із колонки разом із розчинником, що знаходиться між гранулами. Оскільки ступінь дифузії у гранули гелю залежить від розмірів молекул, то елюція речовин із колонки відбувається в порядку зменшення їх молекулярної маси. Молекулярну масу досліджуваного білка визначають шляхом порівняння його об’єму елюювання з аналогічним параметром для білків-маркерів.
Схема розділення білків методом