1.3. Пцр как один из молекулярно-генетических методов.

Молекулярно-генетические методы - большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК. Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов данной группы. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных исследований и может долго сохраняться в замороженном виде. Во многих случаях для успешной диагностики какого-либо признака достаточно исследовать небольшой фрагмент генома. Выделение таких фрагментов стало возможным благодаря открытию ферментов – рестриктаз, которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных участках. Применение этих ферментов в эксперименте дает возможность получить относительно короткие фрагменты ДНК, в которых легко можно определить последовательность нуклеотидов. Получение достаточного количества таких фрагментов осуществляется путем амплификации ДНК при помощи ПЦР.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была открыта в 1983 году американском химиком К. Мюллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. За изобретение метода ПЦР, К.Мюллис получил Нобелевскую премию.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК, в количестве, превышающем исходное в 10⁸ раз (Mullis K.B., Faloona F.A. 1986, Saiki R.K., Scharf S. 1985). Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК. Некоторые области применения ПЦР: высокоэффективное клонирование геномных последовательностей (Булат, Мироненко 1989) , прямое секвенирование митохондриальной и геномной ДНК (Stoflet, E.S., Koeberl, D.D. 1988), анализ вариаций нуклеотидных последовательностей (Horn G.T., Bugawan T. L. 1988) и выявление вирусных патогенов (Kwok, Mack. 1987, Shibata, Arnheim, 1988)

Полимеразная цепная реакция протекает автоматически в программируемом термостате – термоциклере  (амплификаторе).  Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной ДНК, повторяется 30-30 раз в соответствии с заданной программой термоциклера. С каждым новым циклом число молекул матричной ДНК удваивается, по завершении процесса количество копий нарастает в геометрической прогресии. Начиная со второго цикла, в смеси накапливаются специфические продукты амплификации, так называемые "ампликоны", ограниченные по длине двумя  "праймерами".  Именно этот продукт реакции используется для дальнейшей стадии детекции.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

- Два праймера - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

- Термостабильная  ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

- Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфа-та (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) - "строительный материал", используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

- Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы.

- Буферный раствор - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.

- Анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующие интересующий нас участок ДНК, процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Поскольку праймеры включаются в концы продуктов застройки, они детерминируют сам продукт реакции-фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5'-концами праймеров на исследуемом участке ДНК.

Праймеры для ПЦР обычно имеют длину 20 нуклеотидов. Можно синтезировать и более длинные затравки, но они редко бывают необходимы. К 5'-концу праймера можно присоединить последовательность, не комплементарную исследуемому образцу. Такие последовательности включаются в двуцепочечные продукты ПЦР, что обеспечивает возможность введения сайтов рестрикции (Булат, Мироненко 1989) или регуляторных элементов (к примеру промоторов в концы амплифицированных последовательностей (Stoflet, Koeberl 1988) . Если о подлежащей амплификации последовательности имеется только ограниченная информация, можно использовать и более короткие праймеры с учетом поправки на изменение стабильности «посадки» праймера при температуре достройки.

Полимеразная цепная реакция предусматривает инкубацию образцов при тех температурах, соответствующих трем этапам цикла амплификации, - денатурации, отжигу и достройке. Обычно двухцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрева образца до 90-95 С, затем проводят отжиг, охлаждая образец до 40-60 С, и далее нагревают до 70-75 С, чтобы осуществить достройку отожженных затравок с помощью полимеразы. Время инкубации при 70-75 С варьирует в зависимости от длины амплифицируемой последовательности.

Обычно длительность смены температур для 100мкл реакционной смеси в 1,5-мл пробирках и водяных банях, настроенных на 72, 93 и 55 , следующая:

1)72-93 -1 мин,

2)93-55 – 1 мин,

3)55-72 – 45с.

Как правило, разделение цепей происходит, если реакционная смесь нагрета выше 90 С. Чтобы гарантировать разделение, следует довести температуру смеси до 93 С. Как только этот рубеж достигнут, образец можно охладить до температуры отжига затравки. Температура проведения отжига зависит от длины затравки и содержания в ней GC –пар. Для типичной затравки длиной 20 нуклеотидов и 50%-ным содержанием GC –пар подбор температуры хорошо начинать с 50-60 С.

Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод электрофореза, основанный на разделении фрагментов молекул ДНК по размеру.

Метод горизонтального электрофореза состоит в следующем. Готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, - например, бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254, 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.

 Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку в настоящее время большое развитие получили различные способы секвенирования, то в рутинной работе этот метод используют редко.

Другой способ детекции продуктов амплификации основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов (искусственно синтезированных участков ДНК) с продуктами амплификации, содержащими ту или иную метку, детектируемую специальными приборами. В этом случае чаще всего используют плашечный формат и систему детекции, аналогичную используемой в ИФА. Гибридизационные методы не получили пока широкого распространения из-за их дороговизны, длительности и трудоемкости методических манипуляций. Однако они интересны с точки зрения массового скрининга, т.к. при наличии соответствующего оборудования могут быть легко автоматизированы.