Глава II методика проведения эксперимента и характеристика объекта исследований.

На кафедре общей генетики, селекции и семеноводства имеются самоопыленные линии мутантной сахарной кукурузы, которые были использованы для анализа:

31-40 кремнисто-зубовидная, со средней шириной листа, белым, средним овальным зерном, среднепоздняя, КБГУ

68 – лопающаяся, бордовая, var. japonica, Германия. К - 23296

11-20– сахарная, среднерослая, с узкими листьями, с белым сильно морщинистым зерном средним зерном, удлиненной формы, среднеспелая, КБГУ

70 – восковидная, желтая, США.

66 – крахмалистая, серая, местная США. К - 6897

67 – восковидная, желтая Мадагаскар. К - 21690

49 – кремнистая, желтая, Турция. К - 12217

1-10 - среднерослая, с узкими листьями, с белым сильно морщинистым средним зерном, удлиненной формы, среднеспелая

Д 39 – кремнистая среднерослая, со средней шириной листа, белым, средним овальным зерном, среднепоздняя, КБГУ

Д 17 – сахарная высокорослая, с широкими листьями, со слабоморщинистым белым зерном, средних размеров, овальной формы, среднепоздняя, КБГУ

Д 15 – сахарная, среднерослая, с узкими листьями, с белым слабоморщинистым зерном средним зерном, овальной формы, среднеспелая, КБГУ

69 –пленчатая, США

Выделение ДНК проростков, полученных из семян кукурузы на 5-8 день проводили по следующей методике:

пробподготовка : исследуемую ткань поместить в фарфоровую ступку , добавить физ раствор и гомогенезировать фарфоровым пестиком. Отобрать 50 мкл гомогената для выделения ДНК.

1. Буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки 1 (если они хранились при от 2 – 8 ˚С) прогреть при температуре 64 ˚С до полного растворения кристаллов.

2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл (включая отрицательный контроль выделения). В пробирки внести исследуемые пробы. В пробирку отрицательного контроля (ОК) выделения ДНК внести 100 мкл ОКО.

3. Отдельными наконечниками с аэрозольным барьером внести в каждую пробирку по 400 мкл буфера для лизирующего реагента и по 17 мкл лизирующего реагента . Тщательно перемешать содержимое пробирок.

4. Инкубировать пробирки при температуре 64 ˚С в течении 1 ч , периодически встряхивая на вортексе ( 5 раз через каждые 10 – 12 мин).

5. Осадить нерастворенные частицы образцов центрифугированием при (12-14) тыс об/мин в течение 5 минут.

6. Надосадочную жидкость в объеме 200-350 мкл очень аккуратно ( так, чтобы не попали взвешенные частицы и капли жира ) отобрать отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами и перенести в новые пробирки.

7. Пробы центрифугировать в течении 5 сек при 5 тыс об/мин на микроцентефуге для сброса капель с крышки пробирок.

8. Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, оставить в штативе на 10-15мин, перемешивая через каждые 2 минуты.

9. Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5тыс об/мин в течение 1мин. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

10. Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрефуге в течении 1 мин. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

11. Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 1 мин при ( 10-12) тыс об/мин на микроцентрефуге. Отобрать надосадочную жидкость используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

12. Повторить процедуру отмывки, следуя пункту 11, отобрать супернатант полностью.

13. Поместить пробирки в термостат при температуре 64 ˚С на 5-10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

14. В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ – буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 64 ˚С на 5-8 мин периодически ( 1 раз в мин) встряхивая на вортексе.

15. Процентрифугировать пробирки при ( 12 – 14 ) тыс об /мин в течение 1 мин на микроцентрифуге . Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Параметры ПЦР с   RAPD праймерами:

Денатурация 94˚С – 3 мин.

1.     94˚С – 1 мин.

2.     37˚С – 2 мин.

3.     72˚С – 1 мин

Конечная пролонгация при 72 ˚С – 3 мин.

ПЦР проводилась со следующими RAPD праймерами :

OPA 04 – AATCGGGCTG

OPA 07 – CTGCATCGTG

OPD 05 – TGAGCGGACA

OPC 10 – TGTCTGGGTG

Продукты разделяют в 1,5% агарозном геле при 120 В.

Амплифицированные фрагменты прокрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ свете