Высаливание

Растворы нейтральных солей широко используются не только для повышения растворимости белка, например при выделении его из биологического материала, но и для избирательного осаждения разных белков, т. е. их фракционирования. Процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами называется высаливанием. Характерной особенностью белков, полученных высаливанием, является сохранение ими нативных биологических свойств после удаления соли.

Механизм высаливания состоит в том, что добавляемые анионы и катионы солевого раствора снимают гидратную оболочку белков, являющуюся одним из факторов его устойчивости. Возможно, одновременно происходит и нейтрализация зарядов белка ионами соли, что также способствует осаждению белков.

Способность к высаливанию наиболее выражена у анионов солей. По силе высаливающего действия анионы и катионы располагаются в следующие ряды:

• SO₄^2- > С₆Н₅О₇^3- > СН₃СОО^- > Сl^- > NO₃^- > Вr^- > I^- > CNS^-

• Li⁺ >Na⁺ > К⁺ > Pb⁺ > Сs⁺

Эти ряды называются лиотропными.

Сильным высаливающим эффектом в этом ряду обладают сульфаты. На практике для высаливания белков чаще всего применяют сульфат натрия и аммония. Кроме солей белки осаждают органическими водоотнимающими средствами (этанол, ацетон, метанол и др.). Фактически это то же высаливание.

Высаливание широко используют для разделения и очистки белков, поскольку многие белки различаются по размеру гидратной оболочки и величине зарядов. Для каждого из них имеется своя зона высаливания, т. е. концентрация соли, позволяющая дегидратировать и осадить белок. После удаления высаливающего агента белок сохраняет все свои природные свойства и функции.

Денатурация (денативация) и ренатурация (ренативация)

При действии различных веществ, нарушающих высшие уровни организации белковой молекулы (вторичную, третичную, четвертичную) с сохранением первичной структуры, белок теряет свои нативные физико-химические и, главное, биологические свойства. Это явление называется денатурацией (денативацией). Оно характерно только для молекул, имеющих сложную пространственную организацию. Синтетические и природные пептиды не способны к денатурации.

При денатурации разрываются связи, стабилизирующие четвертичную, третичную и даже вторичную структуры. Полипептидная цепь разворачивается и находится в растворе или в развернутом виде, или в виде беспорядочного клубка. При этом теряется гидратная оболочка и белок выпадает в осадок. Однако осажденный денатурированный белок отличается от того же белка, осажденного путем высаливания, так как в первом случае он утрачивает нативные свойства, а во втором сохраняет. Это указывает на то, что механизм действия веществ, вызывающих денатурацию и высаливание, разный. При высаливании сохраняется нативная структура белка, а при денатурации разрушается.

Денатурирующие факторы делятся на

• физические [показать].

• химические [показать].

Свойства денатурированных белков. Наиболее типичными для денатурированных белков являются следующие признаки.

• Увеличение числа реактивных или функциональных групп по сравнению с нативной молекулой белка (функциональными группами называются группы боковых радикалов аминокислот: СООН, NН₂, SН, ОН). Часть этих групп обычно находится внутри молекулы белка и не выявляется специальными реагентами. Развертывание полипептидной цепи при денатурации позволяет обнаружить эти дополнительные, или скрытые, группы.

• Уменьшение растворимости и осаждение белка (связано с потерей гидратной оболочки, развертыванием молекулы белка с "обнажением" гидрофобных радикалов и нейтрализацией зарядов полярных групп).

• Изменение конфигурации молекулы белка.

• Потеря биологической активности, вызванная нарушением нативной структурной организации молекулы.

• Более легкое расщепление протеолитическими ферментами по сравнению с нативным белком переход компактной нативной структуры в развернутую рыхлую форму облегчает доступ ферментов к пептидным связям белка, которые они разрушают.

Процесс восстановления физико-химических и биологических свойств денатурированного белка называется ренатурацией или ренативацией. Если денатурированный белок (после удаления денатурирующих веществ) вновь самоорганизуется в исходную структуру, то восстанавливается и его биологическая активность