3.2. Вплив поліфенолів з виноградного вина на рівень 3’-нітротирозин-модифікованих протеїнів за дії малих доз іонізуючого випромінювання
NOS є біфункціональним ензимом, адже здатна каталізувати утворення оксиду нітрогену та супероксидного аніон-радикаду. Причиною цього є димерна природа молекули ферменту, в якому дві субодиниці здатні функціонувати незалежно одна від одної. Продукувати оксид нітрогену NOS може лише за високої внутрішньоклітинної концентрації BH4 та L-аргініну [36]
Зростання активності NOS за умов дії малих доз радіації може стати причиною надмірної продукції як NO, так і О2▪–. Продукти NO-синтазної реакції взаємодіють між собою та продукують більш потужний прооксидант та цитотоксин – пероксинітрит. Ця молекула взаємодіє з ліпідами, ДНК і протеїнами, спричиняє їхнє окиснення, нітрування та нітрозилювання, а отже призводить до втрати їхніх функцій, що провокує ушкодження клітин і клітинної смерті [113]. Оскільки АФН важко детектувати in vivo у зв’язку з їхньою високою реактивністю, нітротирозин вважають найкращим біомаркером утворення ONOO– [37].
3.2.1. Накопичення 3’-нітротирозин-модифікованих протеїнів у лейкоцитах щурів за дії іонізуючого випромінювання у дозах 10 та 30 сГр та за умов споживання концентрату поліфенольного комплексу з виноградного вина. За умов споживання контрольними тваринами
49
концентрату ПК на всі терміни дослідження не відмічено достовірних змін вмісту 3’-нітротирозин-модифікованих протеїнів у лізатах лейкоцитів щурів порівняно з контролем (рис. 3.9, рис. 3.10).
Рис. 3.9. Вестерн-блот аналіз 3’-нітротирозин-модифікованих протеїнів лізатів лейкоцитів на 24 (А), 48 (В), 72 (Д) години та на 7 добу (Є) після опромінення у дозі 10 сГр та за дії концентрату природного поліфенольного
50
комплексу з виноградного вина. Вміст нітротирозин-модифікованих протеїнів у відсотках (контроль прийнято за 100%) (Б), (Г), (Е), (Ж), відповідно. М – маркери молекулярної маси.
** – відмінність між показниками контрольної групи (К) та опроміненням (О) вірогідна (Р<0,01); ## - відмінність між показниками групи опромінених тварин (О) та групи, якій вводили концентрат ПК на фоні опромінення (О+ПК) вірогідна (Р<0,01).
Рис. 3.10. Вестерн-блот аналіз 3’-нітротирозин-модифікованих протеїнів лізатів лейкоцитів на 24 (А), 48 (В), 72 (Д) години та на 7 добу (Є) після
51
опромінення у дозі 30 сГр та за дії концентрату природного поліфенольного комплексу з виноградного вина. Вміст нітротирозин-модифікованих протеїнів у відсотках (контроль прийнято за 100%) (Б), (Г), (Е), (Ж), відповідно.
*, ** – відмінність між показниками контрольної групи (К) та опроміненням (О) вірогідна (Р<0,05; Р<0,01); ## - відмінність між показниками групи опромінених тварин (О) та групи, якій вводили концентрат ПК на фоні опромінення (О+ПК) вірогідна (Р<0,01); ++ – відмінність між показниками контрольної групи за введення концентрату ПК (К+ПК) та групи, якій вводили концентрат ПК на фоні опромінення (О+ПК) вірогідна (Р<0,01).
Після опромінення в дозі 10 сГр досліджуваний показник зростав на 29 % 24 годину, на 39 % на 48 годину та на 22 % на 168 годину порівняно з контролем (рис. 3.9 А, Б, В, Г, Є, Ж), що, імовірно, є наслідком ініціації надмірного продукування вмісту АФН та АФО після впливу радіації. Нами виявлено достовірне зниження вмісту протеїнів, модифікованих нітруванням за залишками тирозину, на 28 % на 24 годину та на 32 % на 48 годину після радіаційного впливу у разі введення концентрату ПК порівняно з опроміненням, тобто повернення досліджуваного показника до контрольних значень (рис. 3.9 А, Б, В, Г). Таким чином, споживання тваринами концентрату ПК попереджає наднормове утворення 3’-нітротирозин-модифікованих протеїнів у лейкоцитах периферичної крові щурів після дії рентгенівського випромінювання у дозі 10 сГр.
Як за умов опромінення в дозі 10 сГр, вміст нітротирозину у лізатах лейкоцитів щурів після опромінення в дозі 30 сГр зростав, однак цей показник був значно вищий від контролю – на 37% на 48 годину, на 111% на 72 годину та на 174 % на 168 годину (рис. 3.10 В, Г, Д, Е, Є, Ж). Після опромінення за умов споживання тваринами концентрату ПК на другу добу експерименту відмічено незначне зниження вмісту протеїнів, модифікованих нітруванням за залишками тирозину, а на третю та сьому добу – на 49 % та на 46 %, відповідно, порівняно з досліджуваним показником за опромінення (рис. 3.10
52
Д, Е, Є, Ж), однак цей показник залишався вищим від контрольних значень.
У лейкоцитах периферичної крові всіх груп тварин було відмічено наявність домінуючого протеїну з молекулярною масою приблизно 40 кДа. Цікавим є те, що після опромінення у дозі 30 сГр з’являється два чітких бенди, що відповідають протеїнам з молекулярною масою 40-45 кДа. Це свідчить про те, що за умов впливу іонізуючого випромінювання модифікуються інші протеїни, ніж у нормі, а концентрат ПК впливаючи на сумарний вміст нітрованих протеїнів не здатний спричиняти зміну клітинних мішеней цієї посттрансляційної модифікації.
Отже, інгібуючи активність NOS, концентрат ПК зумовлює зниження індукованої впливом малих доз іонізуючої радіації продукції оксиду нітрогену у лейкоцитах. Це у свою чергу пригнічує утворення пероксинітриту і, у подальшому, опосередковану ним модифікацію протеїнів. Таким чином, пригнічення нітративного стресу в ранній пострадіаційний період є одним із механізмів, що опосередковує позитивний коригуючий вплив поліфенолів виноградного вина на клітини імунної системи за впливу малих доз радіації.
53