2.4. Опромінення піддослідних тварин
Щурів піддавали загальному одноразовому опроміненню в дозах 10 та 30 сГр на установці РУМ-17 з такими параметрами: шкірно-фокусна відстань 95 см, напруга 130 кВ, сила струму 10 мА, фільтри Cu 0,5 мм та Al 1,0 мм, потужність дози – 8,3 мГр·с-1.
Дозу опромінення контролювали клінічним дозиметром типу 27012
(Otto Shön, Німеччина).
29
2.5. Забір крові та зразків тканин
На 24, 48, 72 та 168 години після дії радіації щурів ефірним наркозом вводили в хірургічну стадію. Забір зразків проводили після декапітації тварин.
Відбирали висхідну, дугу аорти та її грудну частину, корковий шар правої нирки. Виділені тканини та лейкоцити одразу ж заморожували при –70° С.
Кров збирали у фарфорові чашки. Як антикоагулянт використовували гепарин (кінцеве розведення гепарин : цільна кров = 1:100).
2.6. Виділення лейкоцитів [10]
Готували розчин фікол-тріомбрасту змішуванням 9,677 г фіколу (Picolle-400, "Farmacia", Швеція), 122,5 мл дистильованої води та 20 мл 76% тріомбрасту ("Фармон", Україна) для отримання суміші густиною 1,076-1,078 г/см3.
У центрифужну пробірку вносили суміш фікол-тріомбрасту, на яку обережно нашаровували 5-7 мл крові, розведеної забуференим фізіологічним розчином (ЗФР, рН 7,4, складом 8,5 г NaCl; 0,22 г KCl; 1,071 г Na2HPO4; 0,2 г KH2PO4). Центрифугували 30 хвилин при 1000 об./хв. Після центрифугування з пробірки віббирали лейкоцити, клітини двічі відмивали у ЗФР впродовж 5 хв при 1500 об./хв. Надосадову рідину відбирали, отримані лімфоцити розводили у ЗФР.
2.7. Підрахунок кількості лейкоцитів у камері Горяєва [25]
До 20 мкл розчину 0,05% метиленового зеленого, приготовленого на 3% оцтовій кислоті (CH3COOH лізує еритроцити, а метиленовий синій фарбує ядра лейкоцитів), додавали 20 мкл суспензії лейкоцитів, суміш ретельно
30
перемішували. Заповнювали нею камеру Горяєва, залишали її на 1–2 хв в горизонтальному положенні для осідання лейкоцитів. Лейкоцити підраховували в двадцяти великих квадратах.
Розрахунок кількості лейкоцитів проводили за формулою:
хзаг
=
,
де Х – концентрація клітин, млн./мл.
2.8. Отримання лізатів лейкоцитів та зразків тканин
Гомогенізацію заморожених тканин аорти та коркового шару нирки для визначення активності ензимів антиоксидантної системи проводили на льодяній бані при 4°C за допомогою ручного гомогенізатора Поттера-Эльвейема у присутності гіпотонічного 50 мМ Na-K фосфатного буферу (pH 7,4) з розрахунку 10 мг тканин нирки або 5 мг тканин аорти у 100 мкл буферу, 10 мкл цільної периферичної крові лізували додаванням 90 мкл буферу та 10 млн лейкоцитів – у 600 мкл буферу. Досліджувані показники визначали у супернатанті, отриманому після центрифугування лізатів протягом 15 хв при 14 000 об./хв.
Активність NOS визначали у лізатах, приготованих за аналогічною схемою після додавання до зразків буферу лізису, складом 0,05 М Трис-HCl (рН 7,4), 0,25 М сахароза, 0,001 М ЕДТА, до якого безпосередньо перед додаванням вносили інгібітори протеїназ – 0,5 мкМ апротинін (A1153, Sigma, США), 0,5 мкМ пепстатин (P5318, Sigma, США) та 10 мкМ фенілметилсульфоніл флуорид (PMSF, P7626, Sigma, США). Проводили інкубацію протягом 30 хвилин при 4ºС після чого центрифугували 30 хвилин при 14000 об./хв [69].