2.11. Визначення вмісту 3’-нітротирозину

2.11.1. Лізис лейкоцитів та зразків тканин для електрофоретичного

33

розділення протеїнів [77,127]. Для отримання лізатів 2,5 млн лейкоцитів або 10 мг тканин нирки або 5 мг тканин аорти розсуспендовували у 100 мкл буферу RIPA (50 mM Tris-HCl (pH 7,2); 1% Triton X-100; 1% деоксихолат натрію; 0,1% SDS; 158 mM NaCl; 1 mM EГТА), який містив інгібітори протеаз/пептидаз: пепстатин (20 мкг/мл), апротинін (20 мкг/мл) та PMSF (1 мМ). Суспензію витримували при температурі 4°С протягом 20 хв піля чого центрифугували 15 хв при 12 000 об./хв і температурі 4°С. Супернатант відбирали та прогрівали при 95°С протягом 5 хв у буфері Леммлі (62,5 мМ трис-HCl (pH 6,8), 1 мМ ЕДТА, 2% SDS, 5% β-меркаптоетанол, 10% гліцерин, 0,4% бромфеноловий синій).

2.11.2. Електрофорез протеїнів у поліакриламідному гелі [77,127]. Протеїни (50 мкг) розділяли електрофоретично у блоках 10% поліакриламідного гелю у присутності додецилсульфату натрію (SDS) у буферній системі Леммлі.

Для приготування гелю використовували такі реактиви:

1. Розчин мономерів “АА”: 30% акриламід та 0,8% метиленбісакриламід;

2. Буфер “А” для розділяючого гелю: 0,375 М трис-HCl, pH 8,8;

3. Буфер “Б” для концентруючого гелю: 0,125 М трис-HCl, pH 6,8;

4. 10% персульфат амонію (APS).

5. 10% додецилсульфату натрію (SDS)

6. Буфер для електрофорезу (0,025 М трис-HCl, pH 8,3, 0,192 М гліцин, 0,1% SDS).

В установку для електрофорезу, у простір між двома скляними пластинами вносили 10%-вий розділяючий (3,28 мл H₂О; 2,64 мл «АА»; 2 мл «А»; 0,8 мл SDS; 0,4 мл APS; 0,04 мл ТЕМЕД) та 4%-вий концентруючий (1,83 мл H₂О; 0,39 мл «АА»; 0,75 мл «Б»; 0,3 мл SDS; 0,3 мл APS; 0,03 мл ТЕМЕД) гелі. В електрофоретичну установку заливали буфер для електрофорезу.

Електрофорез проводили протягом 2,5 год при силі струму 15 мА,

34

напрузі 200 В та потужності 50 Вт на одну пластину. При переході проб з концентруючого гелю у розділяючий, силу струму збільшували до 25 мА на одну пластину. Для визначення молекулярної маси протеїнів, бенди яких проявилися, використовували протеїнові стандарти (SDS7B2, «Sigma», США)

2.11.3. Імоноблотинг протеїнів. Отримані розділені протеїни переносили на нітроцелюлозну мембрану під дією електричного поля з наступною обробкою отриманих блотів антитілами Перенесення проводили протягом 2 год при силі струму 250 мА, в буфері, що містив 25 мМ трис-HCl (pH 8,3), 20% метанол та 192 мМ гліцин. Вільні центри зв’язування на мембрані блокували протягом 12 год при 4°С 2% розчином BSA в ЗФР (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na₂HPO₄, 1,7 мМ KH₂PO₄, (pH 7,3)) з 0,05% твін-20.

Згідно до поставленої мети мембрану інкубували з першими антитілами (моноклональні антитіла до 3-нітротирозину, N5538, Sigma, США), розведеними у 10 000 раз у блокуючому буфері, протягом 2 год з наступним промиванням буфером для блокування (5 разів по 3 хв). Як другі антитіла використовували анти-мишачі IgG (AP308P, Millipore, США), кон’юговані з пероксидазою хрону, в розведенні у 1000 у блокуючому буфері. Інкубацію з другими антитілами проводили протягом 1 год, після чого мембрану відмивали ЗФР/0,1% твін-20 (5 разів по 3 хв). Імунореактивні смуги на блотах виявляли за допомогою набору реактивів для посиленої хемілюмінесценції (Millipore, США). Час експонування мембран на рентгенівській плівці залежав від інтенсивності хемілюмінесценції і тривав у середньому 5–15 хв. Плівку проявляли у стандартному фенідон-гідрохіноновому проявнику та фіксували кислим фіксажем. Денситометричний аналіз результатів вестерн-блотингу здійснювали з використанням програми GelPro 3.1.

Для контролю ідентичності вмісту протеїнів у всіх пробах, мембрану відмивали від антитіл буфером для відмивки (ЗФР/0,1% твін-20) та, в

35

подальшому, блокуючим буфером. Після цього її інкубували з першими анти-β-актиновими антитілами (Sigma, США), другими антитілами та проводили експозицію отриманих блотів на рентгенівську плівку.