42. Низкомолекулярные белки межклеточного общения (факторы роста и другие цитокины) и их клеточные рецепторы.

Основные уровни регуляции процессов метаболизма:

- автономная саморегуляция ферментативной активности;

- нейро-гормоналъная регуляция;

- регуляция на генетическом уровне (контроль скорости биосинтеза ферментов и других белков, а также расщепляющих их ферментов - протеиназ).

Автономная саморегуляция как проявление способности белка соче­тать выполнение своей функции (например, катализ) с регулированием ее интенсивности, реализуемым за счет самих участников процесса (например: фермент, его субстрат и/или продукт). Фундаментальные принципы автономной саморегуляции ферментов: кинетические свойства фермента (характеризуемые величинами К_м и У_тах); аллостерические эффекты субстрата и/или продукта (непосредственного либо отдаленного). Саморегуляция простейшей ферментной системы (один фермент, один субстрат, один продукт). Возможные регуляторные проявления в системе из одного субстрата, двух ферментов и двух разных или одинаковых продуктов. Понятие об альтернативных путях метаболизма одного субстрата. Зависимость соотношения интенсивности этих путей от концентрации субстрата; от кинетических параметров обоих ферментов; от аллостерических влияний субстратов (продуктов) на "свой" или альтернативный фермент. Резервные пути метаболизма как способ защиты клетки от нежелательного накопления общего субстрата или одного из продуктов. Роль изоферментов в обеспечении специфики метаболизма в разных типах клеток. Мультиферментные системы - линейные и разветвленные. Особенности их автономной саморегуляции: стабильность концентраций промежуточных метаболитов при колебаниях скорости процесса в целом; ключевой фермент как лимитирующее звено метаболической цепи, чувствительное к аллостерическим влияниям ее метаболитов; пункты вторичного контроля. Представление о метаболических сетях.

Нейро-гормональная регуляция. Медиаторы и гормоны. Эндокринная система. Мембранный и внутриклеточный механизмы действия гормонов. Рецепторы гормонов как ферменты, лишенные каталитического центра и потому готовые лишь к обратимому связыванию лиганда, приводящему к изменению конформации (аналогия с первым этапом ферментативного катализа). Системы трансмембранного преобразования гормонального сигнала. Аденилатциклазная система. Циклические нуклеотиды и другие вторичные посредники между внешним стимулом и внутриклеточными исполнителями. Роль протеинкиназ в обеспечении специфики клеточного ответа. Стероидные и тиреоидные гормоны как регуляторы экспрессии генов, действующие в альянсе с ядерными белками. Локальные системы сигнальных молекул: паракринная, аутокринная и юкстакринная регуляция. Низкомолекулярные белки межклеточного общения (факторы роста и другие цитокины) и их клеточные рецепторы. Активация белков цитоплазмы, избирательно регулирующих транскрипцию генов, как механизм влияния цитокинов на развитие и дифференциацию клеток. Сочетанное воздействие разных цитокинов как фактор, определяющий фенотипическое состояние клетки.

Регуляция на генетическом уровне. Биосинтез белков (в том числе ферментов) как процесс реализации наследственной информации. Репликация ДНК. Молекулярные механизмы выявления и устранения дефектов в структуре ДНК. Ферменты и сигналы транскрипции. Биосинтез информационной (матричной) РНК; ее дозревание (процессинг). Механизмы трансляции: роль рибосомных и транспортных РНК; генетический код, его свойства. Посттрансляционная модификация белка. Молекулярные механизмы регуляции синтеза белка. Экспрессия генов и клеточная дифференцировка. Расшифровка генома человека (2001 г). Механизмы генетической изменчивости. Полиморфизм белков. Генные мутации. Наследственные болезни. Возможности коррекции врожденных дефектов метаболизма. Применение технологиий рекомбинантных и комплементарных ДНК для выявления и идентификации "минорных" белков и в картировании генов. Единство механизмов регуляции всех трех уровней.

43. Катаболизм и анаболизм. Эндэргонические и экзэргонические реак-ции в живой клетке. Макроэргические соединения. Дегид¬ри¬ро¬вание субстратов и окисление водорода (образование воды), как источник энергии для синтеза АТФ.

Катаболизм - процесс расщепления органических молекул до конечных продуктов. Конечные продукты превращений органических веществ у животных и человека - СО₂, Н₂О и мочевина. В процессы катаболизма включаются метаболиты, образующиеся как при пищеварении, так и при распаде структурно-функциональных компонентов клеток. Реакции катаболизма сопровождаются выделением энергии (экзергонические реакции).

Анаболизм объединяет биосинтетические процессы, в которых простые строительные блоки соединяются в сложные макромолекулы, необходимые для организма. В анаболических реакциях используется энергия, освобождающаяся при катаболизме (эндергонические реакции).

Направление химической реакции определяется значением ΔG.

Если эта величина отрицательна, то реакция протекает самопроизвольно и сопровождается уменьшением свободной энергии. Такие реакции называют экзергоническими.

Если при этом абсолютное значение ΔG велико, то реакция идёт практически до конца, и её можно рассматривать как необратимую.

Если ΔG положительно, то реакция будет протекать только при поступлении свободной энергии извне; такие реакции называют эндергоническими.

Если абсолютное значение ΔG велико, то система устойчива, и реакция в таком случае практически не осуществляется. При ΔG, равном нулю, система находится в равновесии.

В биологических системах термодинамически невыгодные (эндергонические) реакции могут протекать лишь за счёт энергии экзергонических реакций. Такие реакции называют энергетически сопряжёнными. Многие из этих реакций происходят при участии аденозинтрифосфата (АТФ), играющего роль сопрягающего фактора.

Реакция фосфорилирования глюкозы свободным фосфатом с образованием глюкозо-6-фосфата является эндергонической:

(1) Глюкоза + Н₃РО₄ → Глюкозо-6-фосфат + Н₂О (ΔG = +13,8 кДж/моль).

Для протекания такой реакции в сторону образования глюкозо-6-фосфата необходимо её сопряжение с другой реакцией, величина свободной энергии которой больше, чем требуется для фосфорилирования глюкозы.

(2) АТФ → АДФ + Н₃РО₄ (ΔG = -30,5 кДж/моль).

При сопряжении процессов (1) и (2) в реакции, катализируемой гексокиназой, фосфорилирование глюкозы легко протекает в физиологических условиях; равновесие реакции сильно сдвинуто вправо, и она практически необратима:

(3) Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ (ΔG = -16,7 кДж/моль).

В живых организмах существует целая группа органических фосфатов, гидролиз которых приводит к освобождению большого количества свободной энергии. Такие соединения называют высокоэнергетическими фосфатами (макроэргические соединения)

Соединение	Продукты реакции	- ΔG0' , ккал/моль	- ΔG0', кДж/моль
Фосфоенолпируват	Пируват + Н3РО4	14,8	61,86
1 ,3-Бисфосфоглицерат	3-фосфоглицерат + Н3РО4	13,0	54,34
Карбамоилфосфат	Карбамат + Н3РО4	12,0	51,83
Креатинфосфат	Креатин + Н3РО4	10,3	43,05
Ацетилфосфат	Уксусная кислота + Н3РО4	10,3	43,05
АТФ	АДФ + Н3РО4	7,3	30,51
АДФ	АМФ + Н3РО4	6,6	27,59
Дифосфат(Н4Р2О7)	2 Н3Р04	6,6	27,59
Глюкозо- 1 -фосфат	Глюкоза + Н3РО4	5,0	20,90
Фруктозо-6-фосфат	Фруктоза + Н3РО4	3,8	15,88
Глюкозо-6-фосфат	Глюкоза + Н3РО4	3,3	13,79
Глицеролфосфат	Глицерин + Н3РО4	2,2	8,36

АТФ - молекула, богатая энергией, поскольку она содержит две фосфоаншдридные связи (β, γ). При гидролизе концевой фосфоангидридной связи АТФ превращается в АДФ и ортофосфат Рi При этом изменение свободной энергии составляет -7,3 ккал/моль. При условиях, существующих в клетке в норме (рН 7,0, температура 37 °С), фактическое значение ΔG0' для процесса гидролиза составляет около -12 ккал/моль. Величина свободной энергии гидролиза АТФ делает возможным его образование из АДФ за счёт переноса фосфатного остатка от таких высокоэнергетических фосфатов, как, например, фосфоенолпируват или 1,3-бисфосфоглицерат; в свою очередь, АТФ может участвовать в таких эндергонических реакциях, как фосфорилирование глюкозы или глицерина. АТФ выступает в роли донора энергии в эндергонических реакциях многих анаболических процессов. Некоторые биосинтетические реакции в организме могут протекать при участии других нуклеозидтрифосфатов, аналогов АТФ; к ним относят гуанозинтрифосфат (ГТФ), уридинтрифосфат (УТФ) и цитидинтрифосфат (ЦТФ). Все эти нуклеотиды, в свою очередь, образуются при использовании свободной энергии концевой фосфатной группы АТФ. Наконец, за счёт свободной энергии АТФ совершаются различные виды работы, лежащие в основе жизнедеятельности организма, например, такие как мышечное сокращение или активный транспорт веществ.

Таким образом, АТФ - главный, непосредственно используемый донор свободной энергии в биологических системах. В клетке молекула АТФ расходуется в течение одной минуты после её образования. У человека количество АТФ, равное массе тела, образуется и разрушается каждые 24 ч.

Использование АТФ как источника энергии возможно только при условии непрерывного синтеза АТФ из АДФ за счёт энергии окисления органических соединений. Цикл АТФ-АДФ - основной механизм обмена энергии в биологических системах, а АТФ - универсальная "энергетическая валюта".

44. НАД-зависимые и флавиновые дегидрогеназы, убихинон-дегидрогеназа, цитохромы в, с, с1, а1 и а3 как компоненты дыхательной цепи.

Никотинамидзависимые дегидрогеназы содержат в качестве коферментов NAD⁺ или NADP⁺ (см. раздел 2). NAD⁺ и NADP⁺ - производные витамина PP.

Эти коферменты входят в состав активных центров дегидрогеназ, но могут обратимо диссоциировать из комплекса с апоферментами и включаются в состав фермента в ходе реакции. Субстраты NAD- и NADP-зависимых дегидрогеназ находятся в матриксе митохондрий и в цитозоле. Рабочей частью никотинамидных коферментов служит никотинамид.

Большинство дегидрогеназ, поставляющих электроны в ЦПЭ, содержат NAD⁺. Они катализируют реакции типа:

R-CHOH-R₁ + NAD⁺↔ R-CO-R₁ + NADH + Н⁺.

Таким образом, NAD⁺, присоединяя протоны и электроны от различных субстратов, служит главным коллектором энергии окисляемых веществ и главным источником электронов, обладающих высоким энергетическим потенциалом, для ЦПЭ. NADPH не является непосредственным донором электронов в ЦПЭ, а используется почти исключительно в восстановительных биосинтезах . Однако возможно включение электронов с NADPH в ЦПЭ благодаря действию пиридиннуклеотид трансгидрогеназы, катализирующей реакцию:

NADPH + NAD⁺ ↔ NADP⁺ + NADH.

Флавиновые дегидрогеназы содержат в качестве коферментов FAD или FMN. Эти коферменты образуются в организме человека из витамина В₂. Флавиновые коферменты прочно связаны с апоферментами. Рабочей частью FAD и FMN служит изоаллоксазиновая сопряжённая циклическая система.

FAD служит акцептором электронов от многих субстратов в реакциях типа:

R-CH₂-CH₂-R₁ + Е (FAD) ↔ R-CH=CH-R₁ + Е (FADH₂),

где Е - белковая часть фермента.

Большинство FAD-зависимых дегидрогеназ - растворимые белки, локализованные в матриксе митохондрий. Исключение составляет сукцинат-дегидрогеназа, находящаяся во внутренней мембране митохондрий. К FMN-содержащим ферментам принадлежит NADH-дегидрогеназа, которая также локализована во внутренней мембране митохондрий; она окисляет NADH, образующийся в митохондриальном матриксе.

Цепь переноса электронов от NADH и FADH₂ на кислород Перенос электронов от NADH к О₂ включает ряд переносчиков, которые локализованы во внутренней мембране митохондрий. За исключением убихинона и цитохрома С, это сложные белковые комплексы.

NADH-дегидрогеназа (NADH-Q-редуктаза, комплекс I) состоит из нескольких полипептидных цепей. Роль простетической группы играет FMN. Единственный субстрат фермента - NADH, с которого 2 электрона и протон переносятся на FMN с образованием FMNH₂. Второй протон поглощается из матрикса. Реакция протекает по уравнению:

NADH + Н⁺ + Е (FMN) → NAD⁺ + Е (FMNH₂)

С FMNH₂ электроны переносятся затем на ряд железо-серных белков (FeS), играющих роль второй простетической группы в молекуле NADH-дегидрогеназы. Атомы железа в этих белках (негемовое железо) собраны в несколько групп, так называемых железо-серных центров. FeS-центры входят в состав многих белков (флавопротеинов, цитохромов), участвующих в окислительно-восстановительных реакциях. Известны 3 типа FeS-центров (FeS, Fe₂S₂, Fe₄S₄), в которых атом железа связан с атомом серы остатков цистеина или неорганической серы. NADH-дегидрогеназа содержит несколько центров типа Fe₂S₂ и Fe₄S₄ Атомы железа в таких центрах могут принимать и отдавать электроны поочерёдно, переходя в ферро- (Fe₂₊) и ферри- (Fe₃₊) состояния. От железо-серных центров электроны переносятся на кофермент Q (убихинон).

Обозначение этого жирорастворимого хинона происходит от первой буквы английского названия хинона (quinone), а название убихинон отражает его широкую распространённость в природе (ubiquitous - вездесущий). Молекулы убихинона в зависимости от источника, из которого они выделены, различаются длиной углеводородной цепи, которая у млекопитающих содержит 10 изопреноидных звеньев и обозначается как Q₁₀. В процессе переноса электронов с NADH-дегидрогеназы через FeS на убихинон он обратимо превращается в гидрохинон. Убихинон выполняет коллекторную функцию, присоединяя электроны от NADH-дегидрогеназы и других флавинзависимых дегидрогеназ, в частности, от сукцинат-дегидрогеназы. Убихинон участвует в реакциях типа:

Е (FMNH₂) + Q → Е (FMN) + QH₂.

Цитохромы или гемопротеины присутствуют во всех типах организмов. В клетках эукариотов они локализованы в митохондриальных мембранах и в ЭР. Известно около 30 различных цитохромов. Все цитохромы в качестве простетической группы содержат гем . Их многообразие обусловлено:

различием боковых цепей в структуре тема;

различием в структуре полипептидных цепей;

различием в способе связи полипептидных цепей с гемом.

В зависимости от способности поглощать свет в определённой части спектра все цитохромы делят на группы а, b, с. Внутри каждой группы отдельные виды с уникальными спектральными свойствами обозначают цифровыми индексами (b, b₁, b₂ и т.д.).

Структурные особенности разных видов цитохромов определяют различие в их окислительно-восстановительных потенциалах. В ЦПЭ участвуют 5 типов цитохромов (а, а₃, b, с, с₁). За исключением цитохрома с, все цитохромы находятся во внутренней мембране митохондрий в виде сложных белковых комплексов.

QН₂-дегидрогеназа (коэнзим Q-цитохром с-ре-уктаза, комплекс III) состоит из 2 типов цитохромов (b₁ и b₂) и цитохрома с₁. QН₂-дегидрогеназа переносит электроны от убихинола на цитохром с. Внутри комплекса III электроны передаются от цитохромов b на FeS-центры, на цитохром с₁, а затем на цитохром с. Группы тема, подобно FeS-центрам, переносят только по одному электрону. Таким образом, от молекулы QH₂ 2 электрона переносятся на 2 молекулы цитохрома b. В качестве промежуточного продукта в этих реакциях переноса электронов возможно образование свободного радикала се-михинона. В цитохромах типа b гем не связан ковалентно с белком, а в цитохромах с₁ и с он присоединяется к белку при помощи тиоэфирных связей. Эти связи образуются путём присоединения 2 цистеиновых остатков к винильным группам гема.

Цитохром С - периферический водорастворимый мембранный белок с молекулярной массой 12 500 Д, имеющий одну полипептидную цепь из 100 аминокислотных остатков, и молекулу гема, ковалентно связанную с полипептидом.

Цитохромоксидаза (комплекс IV) состоит из 2 цитохромов типа аа₃ каждый из которых имеет центр связывания с кислородом. Цитохромы а и а₃ имеют характерную железопорфириновую простетическую группу, называемую гемом А и отличающуюся от гема цитохромов с и c₁. Он содержит формильную группу вместо одной из метальных групп и углеводородную цепь вместо одной из винильных групп. Другая особенность комплекса а-а₃ - наличие в нём ионов меди, связанных с белковой астью в так называемых CuA-центрах. Перенос электронов комплексом а-а₃ включает реакции:

Cu⁺ ↔ Cu²⁺ + e, Fe²⁺ ↔ Fe³⁺ + e.

Комплекс цитохромов а-а₃ непосредственно реагирует с молекулярным кислородом.

45. Строение митохондрий и структурная организация дыхательной це¬пи. Трансмембранный электрохимический потенциал как про¬ме¬жуточная форма энергии при окислительном фосфорилировании. Каждая митохондрия окружена оболочкой, состоящей из двух мембран; между ними — межмембранное пространство. Отграниченное внутренней мембраной пространство называется матриксом. В матриксе содержатся большая часть ферментов, участвующих в цикле Кребса, протекает окисление жирных кислот, располагаются митохондриальные ДНК,РНК и рибосомы. Внутренняя мембрана образует многочисленные гребневидные складки — кристы, существенно увеличивающие площадь ее поверхности. Наружная мембрана митохондрий имеет маленькие отверстия, образованные специальными белками, через которые могут проникать небольшие молекулы и ионы. Внутренняя мембрана таких отверстий не имеет; на ней, на стороне, обращенной к матриксу, располагаются особые молекулы АТФ-синтазы, состоящие из головки, ножки и основания. При прохождении через них протонов происходит синтез АТФ. В основании частиц, заполняя собой всю толщу мембраны, располагаются компоненты дыхательной цепи. Наружная и внутренняя мембраны в некоторых местах соприкасаются, там находится специальный белок-рецептор, способствующий транспорту митохондриальных белков, закодированных в ядре, в матрикс митохондрии.

Протонный градиент и электрохимический потенциал Перенос электронов по дыхательной цепи от NADH к кислороду сопровождается выкачиванием протонов из матрикса митохондрий через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. На эту работу затрачивается часть энергии электронов, переносимых по ЦПЭ.

Протоны, перенесённые из матрикса в межмембранное пространство, не могут вернуться обратно в матрикс, так как внутренняя мембрана непроницаема для протонов. Таким образом, создаётся протонный градиент, при котором концентрация протонов в межмембранном пространстве больше, а рН меньше, чем в матриксе. Кроме того, каждый протон несёт положительный заряд, и вследствие этого появляется разность потенциалов по обе стороны мембраны: отрицательный заряд на внутренней стороне и положительный - на внешней. В совокупности электрический и концентрационный градиенты составляют электрохимический потенциал ΔμН⁺ - источник энергии для синтеза АТФ. Так как наиболее активный транспорт протонов в межмембранное пространство, необходимый для образования ΔμН⁺, происходит на участках ЦПЭ, соответствующих расположению комплексов I, III и IV, эти участки называют пунктами сопряжения дыхания и фосфорилирования. Механизм транспорта протонов через митохондриальную мембрану в пунктах сопряжения недостаточно ясен. Однако установлено, что важную роль в этом процессе играет KoQ. Наиболее детально механизм переноса протонов при участии KoQ изучен на уровне комплекса III. KoQ переносит электроны от комплекса I к комплексу III и протоны из матрикса в межмембранное пространство, совершая своеобразные циклические превращения, называемые Q-циклами. Донором электронов для комплекса III служит восстановленный убихинон (QH₂), а акцептором - цитохром с. Цитохром с находится с внешней стороны внутренней мембраны митохондрий; там же располагается активный центр цитохрома с₁ с которого электроны переносятся на цитохром с. В мембране существует стационарный общий фонд Q/QH₂, из которого каждая молекула QH₂ в одном цикле обеспечивает перенос протонов из матрикса в межмембранное пространство и электронов, которые в конечном итоге поступают на кислород. На работу, совершаемую при выкачивании протонов, расходуется часть свободной энергии, которая освобождается при переносе электронов по градиенту редокс-потенциала. Энергия электрохимического потенциала (∆μH⁺) используется для синтеза АТФ, если протоны возвращаются в матрикс через ионные каналы АТФ-синтазы.