- •Методические указания
- •4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы Лабораторная диагностика гельминтозов и протозоозов
- •Область применения
- •Раздел 1. Лабораторная диагностика
- •1.1. Лабораторная диагностика кишечных гельминтозов
- •Отбор проб и условия доставки биологического материала в лабораторию для паразитологического исследования
- •Отбор проб кала
- •1.1.1.2.2. Методы седиментации Метод формалин-эфирной или уксусной седиментации
- •1.1.1.2. Микроскопические методы
- •1.1.1.2.1. Метод толстого мазка под целлофаном по Като и Миура
- •1.1.1.2.3. Модификация метода седиментации с применением одноразовых концентраторов "parasep"
- •1.1.1.2.4. Модификация метода седиментации с применением минисистемы "Real"
- •1.1.1.2.5. Методы исследования кала с применением флотационных растворов
- •1.1.1.3. Методы исследования кала на личинки гельминтов Метод Бермана
- •Метод Бермана в модификации Супряги
- •Метод Харада-Мори в модификации Маруашвили (метод культивирования личинок на фильтровальной бумаге)
- •1.1.1.4. Методы исследования перианальных отпечатков
- •Метод исследования перианального отпечатка с применением липкой ленты по Грэхэму
- •Метод исследования перианального отпечатка с применением стеклянных глазных палочек с клеевым слоем по Рабиновичу
- •1.1.1.6. Методы исследования желчи дуоденального содержимого (желчи, мокроты, лаважной жидкости и мочи)
- •Методы исследования дуоденального содержимого (желчи)
- •Методы исследования желчи с центрифугированием
- •Методы исследования мокроты и лаважной жидкости
- •Методы исследования нативного мазка мокроты
- •Методы исследования нативного мазка мокроты и лаважной жидкости с центрифугированием
- •Методы исследования мочи
- •Метод концентрации мочи
- •Метод фильтрации мочи
- •1.1.2. Диагностические признаки возбудителей гельминтозов
- •1.2.2. Лабораторная диагностика альвеолярного эхинококкоза
- •1.2.3. Метод исследования жизнеспособности паразита in vivo (биопроба)
- •1.3. Лабораторная диагностика трихинеллеза
- •1.3.1. Метод трихинеллоскопии
- •Компрессорная трихинеллоскопия
- •1.3.2. Методы переваривания в искусственном желудочном соке Классический метод переваривания по Березанцеву ю.А.
- •Ускоренный метод переваривания по Владимировой п.А.
- •1.4. Лабораторная диагностика филяриозов
- •1.4.1. Лабораторная диагностика онхоцеркоза
- •Метод исследования необогащенного нативного препарата
- •Метод исследования обогащенного препарата
- •1.4.2. Лабораторная диагностика филяриозов лимфатической системы (вухериоза и бругиоза)
- •Метод исследования нативного мазка крови из пальца
- •Микрокапиллярный метод обнаружения живых микрофилярий по Супряге
- •Методы исследования венозной крови
- •Метод концентрации микрофилярий в осадке по Кнотту
- •Метод мембранной фильтрации микрофилярий по Беллу, модифицированный Супрягой и Андреенковым
- •Микроскопическое исследование препаратов крови
- •1.4.3. Методы диагностики подкожного дирофиляриоза
- •1.4.4. Диагностика сердечно-легочного дирофиляриоза
- •Раздел 2. Лабораторная диагностика протозоозов
- •2.1. Лабораторная диагностика протозойных инфекций кишечника
- •2.1.1. Микроскопические методы исследования кала на простейшие кишечника
- •Основные методы исследования кала на простейшие кишечника
- •2.1.2. Специальные методы исследования кала на простейшие кишечника
- •Метод приготовления влажного мазка нативного кала с физиологическим раствором, растворами Люголя и метиленового синего
- •Методы приготовления постоянных окрашенных препаратов кала
- •Метод окрашивания трихромовой краской
- •Модифицированный метод окрашивания по Цилю-Нильсену
- •2.1.3. Диагностические признаки трофозоитов и цист кишечных простейших
- •2.1.4. Экспресс-тест для определения антигенов лямблий и криптоспоридий в пробах кала
- •2.2. Лабораторная диагностика трипаносомозов
- •2.2.1. Метод исследования нативных препаратов крови
- •Метод исследования толстой капли
- •2.2.2. Метод исследования неокрашенных мазков из лимфатических узлов
- •2.2.3. Метод исследования неокрашенных мазков из спинно-мозговой жидкости
- •2.2.4. Диагностические признаки возбудителей трипаносомоза
- •2.3. Лабораторная диагностика лейшманиозов
- •Отбор проб биологического материала на наличие возбудителей кожного лейшманиоза
- •Отбор проб биологического материала на наличие возбудителей висцерального лейшманиоза
- •2.3.1. Микроскопические методы исследований на лейшманиозы
- •2.3.2. Посев возбудителей лейшманиозов на питательную среду с последующим культивированием
- •Приготовление питательной среды
- •2.3.3. Диагностические признаки возбудителей лейшманиозов
- •Раздел 3. Автоматизированные системы микроскопирования с программным модулем "Паразитология"
- •Раздел 4. Лабораторная диагностика паразитозов методом полимеразной цепной реакции (пцр-диагностика) Введение
- •Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
- •4.1. Подготовка к анализу
- •4.1.1. Проведение анализа. Выделение днк. Метод выделения днк с помощью набора Diatom dna Prep 100/200
- •Амплификация
- •4.1.2. Проведение электрофореза в агарозном геле
- •4.2. Полимеразная цепная реакция и рестрикция (пцр) на идентификацию возбудителей лейшманиозов Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы для пцр-исследования и рестрикции
- •4.2.1. Проведение полимеразной цепной реакции (пцр) Выделение днк
- •4.2.2. Выделение днк коммерческим набором*
- •Амплификация
- •Реакционная смесь для пцр
- •Условия амплификации
- •Проведение электрофореза в агарозном геле
- •Рестрикционный анализ
- •Реакционная смесь для рестрикции
- •Размеры фрагментов рестрикции
- •Информативность микроскопических методов исследований
- •Морфологическое строение яиц гельминтов
- •Взрослые особи возбудителей нематодозов
- •Морфологическое строение зрелых члеников цестод
- •Морфологическое строение личинок нематод
- •Морфологическое строение кишечных простейших
- •Морфологическое строение микрофилярий
- •Диагностические признаки взрослых дирофилярий
- •I. Химические консерванты, применяемые для консервации и хранения половозрелых гельминтов или их фрагментов, яиц и личинок гельминтов
- •II. Обесцвечивающий раствор спиртовой уксусной кислоты (n 1):
- •III. Раствор буферного метиленового синего (n 2)
- •IV. Буферный раствор для окраски по Романовскому-Гимза
- •Реагенты, растворы и методы их приготовления
- •V. Раствор глицерина с малахитовым зеленым или раствор глицерина с метиленовым синим:
- •VI. Спиртовый раствор йода:
- •VII. Раствор Люголя
- •VIII. Фосфатный раствор метиленового синего:
- •XIV. Раствор лимонно-кислого натрия 2%-й:
- •XV. Раствор краски трихром:
- •XVI. Приготовление раствора Като:
- •XVII. Пропись клея для исследования перианальных соскобов на энтеробиоз по методу Рабиновича:
Приготовление питательной среды
Приготовление полужидкой среды
1) В мерной колбе на 200 мл перемешать все компоненты: 2,5 г бактериологического агара, 1 г бактериологического пептона, 0,5 г хлористого натрия, 0,3 г говяжьего экстракта, 100 мл дистиллированной воды. Приготовленную агарную основу стерилизовать автоклавированием, затем остудить до 50-45 °С.
2) На водяной бане нагреть питательную среду 199 с солями Хенкса с глутамином до 45-50 °С.
3) В новой колбе к 1 части теплой агарной основы добавить 7 частей теплой питательной среды, перемешать встряхиванием, придавая полужидкую консистенцию.
4) Добавить к этой смеси свежую, стерильно взятую, дефибринированную нормальную кровь кролика или человека в соотношении 1:10. Добавить пенициллин 200 Ед/мл и стрептомицин 200 мг/мл, тщательно перемешать встряхиванием.
5) Среду разлить в пробирки по 1,5-2,0 мл. Хранить при 4 °С до 3 месяцев.
Приготовление питательной среды NNN
1) В мерной колбе на 200 мл перемешать все компоненты: 1,4 г бактериологического агара, 0,6 г хлористого натрия и 90 мл дистиллированной воды.
2) Приготовленную агарную основу стерилизовать автоклавированием, затем остудить до 50-45 °С.
3) Добавить 15 мл стерильно взятой дефибринированной крови кролика или человека, перемешать, вращая колбу.
4) Разлить в пробирки по 2-4 мл, после этого пробирки в слегка наклонном положении охладить до застывания или в холодильнике (косой агар) и поместить в термостат с температурой 37 °С для контроля стерильности и получения конденсационной жидкости. Пробирки хранить при 4 °С до 3 месяцев.
5) Перед использованием для культивирования лейшманий в пробирки с застывшим агаром добавить 2-3 мл среды 199 с солями Хенкса с глутамином или среды RPMI-1640 с глутамином. Для подавления роста бактериальной флоры в жидкую питательную среду добавить антибиотики: пенициллин 200 Ед/мл и стрептомицин 200 мг/мл, тщательно перемешать встряхиванием; рН среды должен составлять 7,4-7,6.
Примечание. При выделении и культивировании возбудителя использовать одну из представленных питательных сред.
Выделение и культивирование возбудителя
1) Подготовить пробирки со средой: нагреть до комнатной температуры и подписать. При возможности в стерильных условиях добавить клеточный материал в пробирку: несколько капель пунктата костного мозга, лимфатического узла при висцеральном лейшманиозе; соскоб со стенок разреза края поражения при наличии язвы или папулы.
2) Пробирки поместить в термостат на 25 °С, в лабораторный журнал записывают имя пациента, материал для посева, дату посева, а также сведения о больном и иную необходимую информацию.
3) Через 5-10 дней культуру просмотреть. Результат считать положительным, если обнаруживаются промастиготы. В данном случае штамму дать наименование согласно международной классификации.
4) Если через 10-15 дней промастиготы не обнаруживаются, результат считать отрицательным.
5) Перевозка пробирок должна осуществляться с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортирования инфекционных материалов.