Амплификация

Для амплификации фрагмента длиной 300-350 п.н. спейсера ITS1 (internal transcribed spacer) между генами 18S рРНК и 5,8S рРНК использовать следующие олигонуклеотиды (праймеры):

LITSR: 5’ - CTG GAT CAT TTT CCG ATG - 3’;

L5,8S: 5’ - TGA ТАС САС ТТА TCG САС ТТ - 3’.

Концентрацию праймеров для постановки ПЦР следует привести к 10 пкмоль/мкл. Исходные расчетные данные обычно приведены в паспорте на синтетические олигонуклеотиды. В том случае, если известна только оптическая плотность, концентрацию рассчитать по формуле:

,

где - кол-во пар оснований.

Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции представлена в табл.3.

Примечание. Также можно добавить 2,7% ДМСО от финального объема реакционной смеси. В этом случае в равном объеме уменьшить количество вносимой деионизированной воды.

Таблица 3

     

Реакционная смесь для пцр

N п/п	Реактивы	Объем реакционной смеси, мкл
		50	30
1	Деионизированная вода	31,8	17,5
2	Буфер для полимеразной цепной реакции с (10 )	5	3
3	Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (2,5 мМ)	4	2,4
4	Праймер 1 (LITSR)	2,5	1,5
5	Праймер 2 (L5,8S)	2,5	1,5
6	Taq-полимераза (5 Ед/мкл)	0,2	0,1

1) Для приготовления общей реакционной смеси реактивы в пробирку типа Эппендорф вносить на холоде (для этой цели целесообразно использовать настольный кулер для пробирок).

2) Реакционную смесь приготовить на необходимое количество проб, но не менее чем на 5 (оптимальный рабочий раствор для биологических образцов).

3) В пробирки для проведения ПЦР разлить из общей реакционной смеси по 46 мкл (или по 26 мкл в зависимости от выбора исполнителя).

4) В каждую пробирку для проведения ПЦР с реакционной смесью добавить 4 мкл раствора ДНК. Содержимое пробирки перемешать, центрифугировать для того, чтобы сбросить капли на дно пробирки (не более 30 с при 3000 об./мин).

5) При использовании амплификатора, не имеющего нагреваемую крышку, в каждую пробирку добавить каплю минерального масла (17-20 мкл).

6) На каждую партию (10-20 образцов) обязательно приготовить следующие пробы:

отрицательный контроль - дистиллированная вода, для проверки качества амплификации;

положительный контроль - использовать ДНК лейшмании, отличную от ожидаемой в анализе (если исследуются человеческие образцы, следует использовать ДНК не паразитирующих на человеке лейшманий, например L. turanica);

контроль ингибирования - 2 мкл ДНК, использованной в положительном контроле и 2 мкл ДНК исследуемого образца. Сравнение интенсивности полос позитивного контроля и контроля ингибирования укажет на ингибирование ПЦР или его отсутствие.

Исследуемые образцы

Условия амплификации представлены в табл.4.

Таблица 4