Література Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. - Київ-Тернопіль: Укрмед- книга, 2000. - 508 с.

2. Хмелевский Ю.В, Губский Ю.И., Зайцева С.Д. и др. Биологичес­­­кая химия: Практикум. - К.: Вища шк., 1985. - 212 с.

3. Будова та властивості білків, ферментів, вітамінів і гормонів. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 31 с.

4. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 37 с.

Додаткова:

1. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. Підручник .-Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с.

2. Практикум з біологічної хімії. За ред. О.Я.Склярова.- Київ: Здоров’я. –2002. –298 с.

Ферменти та коферменти. Регуляція метаболізму

Тема заняття № 2. Дослідження фізико-хімічних властивостей білків-ферментів. Засвоєння методів виявлення ферментів в біологічних об’єктах.

Цілі заняття:

• Трактувати біохімічні закономірності будови та функціонування різних класів ферментів.

• На основі розуміння фізико-хімічних властивостей білків-ферментів пояснювати залежність активності ферментів від рН середовища, температури та інших факторів.

• Аналізувати активність ферментів плазми крові залежно від їх внутрішньоклітинної та тканинної (органної) локалізації.

• Аналізувати методи виявлення активності ферментів з метою їх оптимального застосування в клініко-лабораторному аналізі.

Теоретичні питання

1. Ферменти як біологічні каталізатори реакцій обміну речовин.

2. Фізико-хімічні властивості білків-ферментів: електрохімічні (поверхневий заряд молекули) властивості, розчинність, термодинамічна стабільність білкових молекул-ферментів, осадження, денатурація, взаємодія з лігандами та її функціональне значення.

3. Прості та складні білки-ферменти, простетичні групи складних білків-ферментів (кофактори, коферменти).

4. Будова ферментів: активний, регуляторний (алостеричний) центри.

5. Номенклатура та класифікація ферментів. Типи реакцій, що каталізують окремі класи ферментів.

6. Властивості ферментів:

• залежність активності ферментів від рН середовища;

• залежність активності ферментів від температури.

7. Специфічність ферментів.

8. Внутрішньоклітинна локалізація ферментів.

9. Тканинна (органи) специфічність ферментів.

10. Методи виявлення ферментів в біологічних об’єктах (кров, слина, сеча, окремі тканини).

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення амілази в слині (реакція з йодом) та в шлунковому соку.

Принцип методу. Амілаза відноситься до класу гідролаз – ферментів, що каталізують розрив хімічних (глікозидних) зв’язків з приєднанням молекули води. Амілаза слини каталізує гідроліз крохмалю через стадію утворення декстринів до дисахариду мальтози, про що свідчить реакція на крохмаль з йодом та реакція Фелінга на мальтозу. Крохмаль утворює з йодом синє забарвлення і не дає забарвлення в реакції Фелінга, оскільки не містить вільних альдегідних груп. Мальтоза містить вільну альдегідну групу, а тому утворює забарвлення з реактивом Фелінга.

Хід роботи. В пробірку № 1 вносять 1,0 мл розведеної в два рази слини, в пробірку № 2 – 1,0 мл шлункового соку. В обидві пробірки додають по 2 мл 1% -го розчину крохмалю, добре перемішують і ставлять в термостат при t=37°C на 15 хв. Після цього вміст пробірок ділять на дві частини і проводять реакцію з йодом (0,1%-ний розчин йоду в 0,2%-ному розчині йодиду калію) на наявність крохмалю та реакцію Фелінга (на наявність мальтози, глюкози).

Результати дослідження заносять в таблицю:

Фермент	Об’єкт дослідження	Субстрат	Умови реакції	Реакція:
				з йодом	Фелінга
Амілаза	Слина	крохмаль	37оС 15 хв.
Амілаза	Шлунковий сік	крохмаль

Висновок:

Завдання 2. Дослідження впливу високих температур на активність a - амілази слини.

Принцип методу. Активність ферментів залежить від температури. Температура, за якої спостерігається максимальна швидкість ферментативної реакції, носить назву – оптимальна температура. При нагріванні до 60-70^оС і вище, ферменти втрачають властивості біологічних каталізаторів. Це пояснюється тепловою денатурацією білкової молекули ферменту. При зниженні температури активність ферментів падає, досягаючи мінімального значення при 0^оС.

Вплив температури на активність амілази слини проявляється у зміні швидкості розщеплення крохмалю цим ферментом за різних температурних умов. Ступінь розщеплення крохмалю визначають за допомогою реакції з йодом.

Хід роботи. В одну пробірку додають 1 мл розведеної в 2 рази слини, в другу – 1 мл розведеної слини після попереднього кип’ятіння (протягом 2 хв.). В обидві пробірки додають по 2 мл 1% -го розчину крохмалю і ставлять в термостат при t=37°C на 15 хв. Після інкубації проводять реакцію з йодом (0,1%-ний розчин йоду в 0,2%-ному розчині йодиду калію).

Результати дослідження заносять в таблицю:

Об’єкт дослідження	Досліджуваний фермент	Субстрат
Слина	a - Амілаза	Крохмаль
Термостат: t=37°C на 10 хв.
Реакція:	з йодом
Спостереження:	слина до кип’ятіння	слина після кип’ятіння
Висновки:

Висновок:

Завдання 3. Вивчення специфічності дії амілази слини та сахарази дріжджів.

Принцип методу. Специфічність дії є однією з найбільш характерних властивостей ферментів і полягає в тому, що кожен фермент діє на перний субстрат чи групу субстратів, які мають подібну структуру. Розрізняють абсолютну, відносну (групову) та стереохімічну специфічність. Висока специфічність ферментів обумовлена їх білковою природою та структурою активного центру.

Амілаза слини розщеплює крохмаль до дисахариду - мальтози і не діє на дисахарид – сахарозу, сахараза розщеплює сахарозу на глюкозу та фруктозу і не діє на крохмаль. Ступінь гідролізу субстратів оцінюють за результатами реакції Фелінга. Мальтоза містить вільну альдегідну групу, а тому утворює забарвлення з реактивом Фелінга, сахароза не містить вільної альдегідної групи, тому не дає реакції з фелінговою рідиною.

Хід роботи.

1. Специфічність амілази: в дві пробірки поміщають по 1,0 мл розведеної в два рази слини. В пробірку № 1 додають 2 мл 1% -го розчину крохмалю, в пробірку № 2 – 2 мл 1% -го розчину сахарози. Обидві пробірки ставлять в термостат при t=37°C на 15 хв. Після закінчення інкубації в обох пробірках проводять реакцію Фелінга.

2. Специфічність сахарази дріжджів: в дві пробірки поміщають по 1,0 мл препарату сахарази дріжджів. Впробірку № 3 додають 2 мл 1% -го розчину сахарози, в пробірку № 4 – 2 мл 1% -го розчину крохмалю. Обидві пробірки ставлять в термостат при t=37°C на 15 хв. Після закінчення інкубації в обох пробірках проводять реакцію Фелінга.

Результати проведеного експерименту заносять в таблицю:

№ пробірки	Фермент	Субстрат	Реакція Фелінга
1
2
3
4

Клініко-діагностичне та практичне значення. Амілаза синтезується переважно в слинних та підшлунковій залозах. Підвищення активності амілази в крові спостерігається при панкреатиті, перитоніті, тромбозі судин, внаслідок введення в організм ряду фізіологічно активних сполук, зокрема морфіну, кодеїну, кортикотропіну (АКТГ) та кортизолу.

Підвищення активності амілази слинних залоз спостерігається при стоматиті, невралгії лицевого нерва, нирковій недостатності, паркінсонізмі. Зниження активності амілази крові спостерігається при психічних захворюваннях, анацидних порушеннях. Зниження вмісту амілази в слині має місце при гіпосалівації, запаленні слинних залоз, тощо.

Висновок: