Література Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. - Київ-Тернопіль: Укрмед- книга, 2000. - 508 с.

2. Хмелевский Ю.В, Губский Ю.И., Зайцева С.Д. и др. Биологичес­­­кая химия: Практикум. - К.: Вища шк., 1985. - 212 с.

3. Будова та властивості білків, ферментів, вітамінів і гормонів. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 31 с.

4. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 37 с.

Додаткова:

1. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. Підручник .-Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с.

2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. В 2 т. – М.:Мир, 1982.

Тема заняття № 4. Вивчення регуляції ферментативних процесів та аналіз механізмів виникнення ензимопатій. Медична ензимологія.

Цілі заняття:

• Аналізувати шляхи та механізми регуляції ферментативних процесів, як основи обміну речовин в організмі в нормі та при патологіях;

• Пояснювати зміни перебігу ферментативних процесів та накопичення проміжних продуктів метаболізму при вроджених (спадкових) та набутих вадах метаболізму - ензимопатіях.

• Аналізувати зміни активності індикаторних ферментів плазми крові при патологіях певних органів та тканин. Теоретичні питання

1. Активація та інгібування ферментів.

• активатори ферментів;

• інгібування ферментів (зворотне, незворотне, конкурентне, неконкурентне).

2. Основні два принципи регуляції швидкості ферментативних реакцій.

3. Регуляція шляхом зміни каталітичної активності ферментів:

• алостеричні ферменти;

• ковалентна модифікація ферментів;

• протеолітична активація ферментів (обмежений протеоліз);

• дія регуляторних білків;

• циклічні нуклеотиди в регуляції ферментативних процесів.

4. Регуляція шляхом зміни кількості ферментів:

• конститутивні та адаптивні ферменти.

5. Ізоферменти, множинні молекулярні форми ферментів.

6. Ензимодіагностика, ензмопатії та ензимотерапія.

7. Зміни активності ферментів плазми та сироватки крові як діагностичні (маркерні) показники розвитку патологічних процесів:

• інфаркт міокарду;

• захворювання печінки;

• захворювання м’язової тканини.

8. Ізоферменти в ензимодіагностиці.

9. Природжені (спадкові) та набуті вади метаболізму, їх клініко-лабораторна діагностика.

10. Використання інгібіторів ферментів в якості лікарських засобів:

• ацетилсаліцилова кислота;

• алопуринол;

• сульфаніламідні препарати.

11. Ензимотерапія - використання ферментів в якості лікарських засобів

Практичні роботи

Завдання 1. Дослідити вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази слини.

Принцип методу. Сполуки, що підвищують активність ферментів, називаються активаторами, а сполуки, що знижують активність ферментів – інгібіторами. До активаторів відносяться іони багатьох металів, зокрема: Na⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Co²⁺ та ряд інших, а також органічні сполуки – проміжні продукти обміну речовин в організмі. Наприклад, жовчні кислоти є активатором ліпази, ацетил-КоА – активатором піруваткарбоксилази, тощо.

Інгібування ферментів поділяють на зворотне та незворотне, В свою чергу зворотне інгібування може бути конкурентним та неконкурентним.

Активатором амілази є хлорид натрію (NaCl), інгібітором – сульфат міді (CuSO₄). Показником впливу цих сполук на активність амілази є ступінь гідролізу крохмалю під дією ферменту в присутності NaCl та CuSO₄.

Хід роботи. Слину розводять в 2 рази. Беруть 3 пробірки. В пробірку № 1 наливають 1 мл води, в пробірку № 2 – 0,8 мл води та 0,2 мл 1% -го розчину NaCl, в пробірку № 3 – 0,8 мл води та 0,2 мл 1% -го розчину CuSO₄. У всі три пробірки додають по 1 мл слини. Вміст перемішують і додають по 2 мл 1 % -го розчину крохмалю, знову перемішують і ставлять в термостат чи на водяну баню при t = 37°C на 15 хв.

Далі у всіх пробірках проводять реакцію з йодом (0,1%-й розчин йоду в 0,2%-му розчині йодиду калію). Спостерігають зміну забарвлення.

Результати роботи заносять у таблицю:

Вміст пробірок	№ пробірки
	1	2	3
Вода	1 мл	0,8 мл	0,8 мл
NaCl, 1%-й розчин	---	0,2 мл	---
CuSO4, 1%-й розчин	---	---	0,2 мл
Слина (розведення 1:2)	1 мл	1 мл	1мл
Крохмаль, 1%-й розчин	2 мл	2 мл	2 мл
Забарвлення після додавання йоду

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко-діагностичне та практичне значення. Інгібітори ферментів широко використовуються в медицині в якості лікарських засобів, зокрема ацетилсаліцилова кислота (аспірин) – інгібітор циклооксигенази (простагландин-синтази) використовується як протизапальний препарат, трисалот – інгібітор трипсину та контрикал – інгібітор протеїназ (зокрема калікреїнів) використовуються при панкреатиті, алопуринол – інгібітор ксантиноксидази застосовується при подагрі, тощо.

Завдання 2. Дослідити вплив фосфаколу та іонів кальцію на активність холінестерази.

Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу нейромедіатора – ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.

Фосфорорганічні сполуки (ФОС, фосфакол) є незворотними інгібіторами холінестерази та ацетилхолінестерази, оскільки ковалентно зв’язуються з активним центром ферменту і гальмують його активність. Препарати ФОС є високотоксичними отрутами для комах (пестициди) та теплокровних тварин. Механізм гальмівної дії полягає у зв’язуванні з ОН-групою серину в активному центрі ферменту.

Зростання концентрації іонів Са²⁺ в нервовому закінчення є безпосереднім біохімічним сигналом, що активує вихід ацетилхоліну через пресинаптичну мембрану, його взаємодію з холінорецепторами постсинаптичної мембрани та розщеплення медіатора в синоптичній щілині ацетилхолінестеразою. Тому іони кальцію є потужним активатором холінестерази.

Метод кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну.

Кількість лугу, що пішла на титрування є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Три пробірки заповнюють реактивами за таблицею.

Вміст пробірок	№ пробірки
	1	2	3
Сироватка крові, мл	0,5	0,5	0,5
Розчин CaCl2, крапель	---	5	---
Розчин фосфаколу, крапель	---	---	5
Інкубація при кімнатній температурі, 5 хвилин
2%-ний розчин ацетилхоліну	1,5	1,5	1,5
Інкубація 10 хвилин
Фенолфталеїн, крапель	2	2	2
Кількість 0,1 М NaOH, що пішла на титрування

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко-діагностичне та практичне значення. Фізіологічно активні сполуки, що є інгібіторами ацетилхолінестерази, мають важливе фармакологічне та токсикологічне значення, оскільки спричиняють значне підвищення концентрації нейромедіатора як в структурах центральної нервової системи, так і в організмі в цілому.

Зворотні інгібітори ацетилхолінестерази застосовуються в медицині з метою збільшення активності холінергічної імпульсації, порушеної при певних неврологічних захворюваннях, таких як атонія кишечника, сечового міхура. Із зазначеною метою застосовуються препарати: Прозерин, Фізостигмін, Галантамін.

Незворотні інгібітори ацетилхолінестерази є потужними нервовими отрутами, які спричиняють різке збудження нервової системи із судомами, порушенням функції серцево-судинної, гастро-інтестинальної та інших фізіологічних систем організму. Найбільш поширеними незворотними інгібіторами є фосфорорганічні сполуки – ФОС. В сільському господарстві для боротьби зі шкідливими комахами використовують : хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос, тощо. Нервово-паралітичними отрутами, що використовуються як бойові отруйні речовини є табун, зарин, зоман, тощо.

Висока чутливість холінестерази до дії фосфорорганічних сполук робить її специфічним біохімічним маркером для виявлення впливу цих отрут на організм людини.