Література Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. - Київ-Тернопіль: Укрмед- книга, 2000. - 508 с.

2. Хмелевский Ю.В, Губский Ю.И., Зайцева С.Д. и др. Биологичес­­­кая химия: Практикум. - К.: Вища шк., 1985. - 212 с.

3. Будова та властивості білків, ферментів, вітамінів і гормонів. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 31 с.

4. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 37 с.

Додаткова:

1. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. – М.: Мир. – 1980. – 364 с.

2. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. - М.: Мир, 1986. - 374 с.

Тема заняття № 5. Дослідження ролі кофакторів та коферментних вітамінів у прояві каталітичної активності ферментів.

Цілі заняття:

• Трактувати роль вітамінів та їх біологічно активних похідних в механізмах каталізу за участю основних класів ферментів.

• Пояснювати застосування антивітамінів як інгібіторів ферментів при інфекційних захворюваннях та при патологіях системи гомеостазу.

• Пояснювати роль металів в механізмі ферментативного каталізу.

• Класифікувати окремі групи коферментів за хімічною природою та типом реакції, яку вони каталізують.

Теоретичні питання

1. Кофактори, коферменти та простетичні групи.

2. Роль іонів металів у функціонуванні ферментів.

3. Класифікація коферментів за хімічною природою та за типом реакції, яку вони каталізують.

4. Коферменти – переносники атомів водню та електронів (розглянути конкретні реакції):

   • НАД⁺, НАДФ⁺ - коферменти – похідні вітаміну РР;

   • ФАД, ФМН – коферменти – похідні вітаміну В₂ – рибофлавіну;

   • роль вітаміну С в окисно-відновних реакціях.

5. Коферменти – переносники хімічних груп (розглянути конкретні реакції):

   • піридоксалеві коферменти;

   • НS-КоА – коензим ацилювання;

   • ліпоєва кислота;

   • уридиндифосфат.

6. Коферменти ізомеризації, синтезу та розщеплення С–С зв’язків (розглянути конкретні реакції):

   • тіаміндифосфат;

   • карбоксибіотин – біологічно активна форма вітаміну Н – біотину;

   • метилкобаламін та дезоксиаденозилкобаламін – похідні вітаміну В₁₂.

Практичні роботи

Завдання 1. Визначити вміст аскорбінової кислоти в сечі як показник забезпеченості організму вітаміном С.

Принцип методу. Для оцінки С-вітамінної забезпеченості організму найбільше поширення отримали прямі методи визначення вмісту аскорбінової кислоти в крові та сечі. Концентрація вітаміну в плазмі крові та виведення його з сечею знаходяться у тісному зв’язку і є показником забезпеченості організму людини вітаміном С.

Аскорбінова кислота в кислому середовищі відновлює молекулярний йод. Поява синього забарвлення вказує на те, що вся аскорбінова кислота з відновленої форми перейшла в окислену і перша надлишкова крапля розчину йоду в присутності крохмалю дає синє забарвлення.

Хід роботи. В колбу відміряють 5 мл сечі і додають 5 крапель 1%-го розчину крохмалю. Титрують розчином йоду до появи синього забарвлення, що не зникає протягом 30 секунд.

Враховуючи, що 1 мл розчину йоду відновлює 1 мкмоль аскорбінової кислоти, обчислюють виділення аскорбінової кислоти за добу за формулою:

Х = а  1  1500 / 5

де а – кількість мл розчину йоду, що пішла на титрування; 1500 – добовий діурез; 5 – об’єм сечі в пробі; Х – вміст аскорбінової кислоти в добовій кількості сечі.

В нормі за добу з сечею виділяється 284-568 мкмоль аскорбінової кислоти.

Завдання 2. Визначити вміст аскорбінової кислоти в плазмі крові як показник забезпеченості організму вітаміном С.

Принцип методу. Аскорбінова кислота в певних умовах легко віддає пару електронів та протонів, а отже є добрим відновником.

Кількісне визначення вітаміну С грунтується на здатності аскорбінової кислоти відновлювати 2,6-дихлорфеноліндофенол (ДХФІФ). Розчин 2,6-ДХФІФ в нейтральному середовищі має синє забарвлення. Поки в розчині є аскорбінова кислота, 2,6-ДХФІФ відновлюється і при цьому знебарвлюється. Після окислення всієї аскорбінової кислоти, надлишок 2,6-ДХФІФ забарвлює розчин в кислому середовищі в слабо рожевий колір.

Хід роботи. До 0,5 мл плазми крові додають таку ж кількість дистильованої води, 1,0 мл 5%-го розчину метафосфорної кислоти і титрують розчином 2,6-ДХФІФ з мікробюретки до появи рожевого забарвлення. Титрування припиняють і відмічають кількість розчину 2,6-ДХФІФ, що пішла на титрування.

Розрахунок проводять за формулою:

Х = а  0,045  1000 / 0,5

де Х – вміст аскорбінової кислоти в плазмі крові; а – кількість 2,6-ДХФІФ, що пішла на титрування; 0,045 – кількість мкмоль аскорбінової кислоти, що відповідає титру розчину 2,6-ДХФІФ; 0,5 – кількість плазми, взятої для аналізу; 1000 – розрахунок на 1 л крові.

В нормі в плазмі крові міститься 34,1 – 90,9 мкмоль аскорбінової кислоти.

Зробити висновки з проведеного дослідження та отриманих результатів.

Завдання 2. Визначення вмісту піровиноградної кислоти в плазмі крові, як показник забезпеченості організму вітаміном В₁.

Принцип методу. До числа показників вітамінної забезпеченості організму вітаміном В₁ відносяться: вміст вітаміну В₁ в крові та сечі, зміна активності тіамінових ферментів – піруватдегідрогеназного комплексу та транскетолази в крові, вміст піровиноградної кислоти в крові та сечі. При нестачі вітаміну В₁ знижується активність піруватдегідрогеназного комплексу, транскетолази та зростає концентрація піровиноградної кислоти в крові.

Піровиноградна кислота з динітрофенілгідразином утворює гідразон, який в лужному середовищі дає червоно-рожеве забарвлення. Інтенсивність забарвлення є пропорційною концентрації піровиноградної кислоти.

Техніка роботи. Беруть дві пробірки. У першу поміщають 1 мл плазми крові № 1, у другу – 1 мл плазми крові № 2. Після цього в обидві пробірки додають по 1 мл 0,1%-го розчину 2,4-динітрофенілгідразину (ДНФГ), змішують і ставлять на 20 хв. у темне місце. Пізніше додають по 1 мл 10%-го розчину натрію гідроксиду і через 10 хв. фотометрують на ФЕКу проти контролю (дистильована вода) при синьому світлофільтрі.

Дані оптичної щільності, які були отримані на ФЕКу, складали: плазма крові № 1 – 0,4; плазма крові № 2 – 0,9.

По готовому графіку визначають кількість піровиноградної кислоти в плазмі крові в мкмоль/л, що відповідає показникам ФЕК. Коефіцієнт перерахунку оптичної щільності в мкмоль/л плазми крові складає – 132.

Зробити висновки з проведеного експерименту.

Клініко-діагностичне значення. У крові здорової людини вміст піровиноградної кислоти складає 70 – 140 мкмоль/л, із сечею за добу виділяється 15 – 25 мг піровиноградної кислоти. Вміст піровиноградної кислоти (разом з молочною кислотою) збільшується під час посиленої м’язової праці, а також при патологічних процесах, що супроводжуються судомами.

Виділення піровиноградної кислоти з сечею зростає при В₁-вітамінній недостатності, серцевій недостатності, а також після введення адреналіну, стрихніну. До збільшення вмісту піровиноградної кислоти призводять токсична дія ацетилсаліцилової кислоти (аспірин), отруєння ртуттю, арсеном, сурмою.