На даному рисунку зображено приклад некрозу тканини

 

У даній таблиці наведено дані порівняльної характеристики некрозу і апоптозу :

 

Ознака	Апоптоз	Некроз
Поширеність	Поодинокі клітини	Група клітин
Індукція	Активується фізіологічними або патологічними стимулами	Різна в залежності від пошкоджуючого фактора
Біохімічні зміни	Енергозалежна фрагментація ДНК ендогенними ендонуклеазами Лізосоми інтактні	Порушення або припинення іонного обміну. З лізосом вивільняються ферменти
Розпад ДНК	Внутрішньоядерна конденсація з розщепленням на фрагменти	Дифузна локалізація в некротизованій клітині
Цілісність клітинної мембрани	Збережена	Порушена
Морфологія	Зморщування клітин і фрагментація	Набухання і лізис клітин
Запальна відповідь	Нема	Зазвичай є
Видалення загиблих клітин	Поглинання (фагоцитоз) сусідніми клітинами	Поглинання (фагоцитоз) нейтрофілами і макрофагами

 

Зміна морфологічних ознак більш чітко виявляється з допомогою електронно-мікроскопічних досліджень. Для клітин, які піддаються апоптозу, характерне:

Зморщення клітини.

Клітина зменшується в розмірах; цитоплазма ущільнюється; органели, які виглядають відносно нормальними, розташовуються більш компактно. Очевидно, що порушення форми та обєму клітини відбувається в результаті активації в апоптотичних клітинах трансглютамінази. Цей фермент викликає прогресивне утворення перехресних зв'язків в цитоплазматичних білках, що призводить до формування своєрідної оболонки під клітинною мембраною, подібно зроговілих клітин епітелію.

Конденсація хроматину.

Це найбільш характерний прояв апоптозу. Хроматин конденсується по периферії, під мембраною ядра, при цьому утворюються чітко окреслені щільні маси різної форми і розмірів. Ядро ж може розриватися на два або кілька фрагментів.

Механізм конденсації хроматину вивчений досить добре. Він обумовлений розщепленням ядерної ДНК в місцях, які зв'язують окремі нуклеосоми, що призводить до розвитку великої кількості фрагментів, в яких число пар основ ділиться на 180 - 200. При електрофорезі фрагменти дають характерну картину. Ця картина відрізняється від такої при некрозі клітин, де довжина фрагментів ДНК різна. Фрагментація ДНК в нуклеосомі відбувається під дією кальцій чутливої ​​ендонуклеази. Ендонуклеаза в деяких клітинах знаходиться постійно (наприклад, в тимоцитах), де вона активується появою в цитоплазмі вільного кальцію, а в інших клітинах синтезується перед початком апоптозу. Однак ще не встановлено, яким чином після розщеплення ДНК ендонуклеазою відбувається конденсація хроматину.

Формування апоптотичних тілець.

У апоптотичній клітині спочатку формуються глибокі інвагінації поверхні з утворенням порожнин, що призводить до фрагментації клітини і формування оточених мембраною апоптотичних тілець, які складаються з цитоплазми і щільно розташованих органел, з або без фрагментів ядра.

 

 

Фагоцитоз апоптотичних клітин або тілець здійснюється навколишніми здоровими клітинами або макрофагами. Апоптотичні тільця швидко руйнуються в лізосомах, а навколишні клітини або мігрують, або діляться, щоб заповнити місце, яке звільнилося після загибелі клітини.

Фагоцитоз апоптотичних тілець макрофагами або іншими клітинами активується рецепторами на цих клітинах: вони захоплюють і поглинають апоптичні клітини. Один з таких рецепторів на макрофагах - рецептор вітронектину, який є ?3-інтегрином і активує фагоцитоз апоптичних нейтрофілів.

 

Молекулярно-генетичні аспекти апоптозу.

 Існує декілька шляхів реалізації апоптозу.

1.     Важливе місце займає шлях, опосередкований фізіологічними індукторами, дія яких реалізується через клітинні рецептори, спеціально призначені для включення програми апоптозу. Цей шлях передачі сигналу запрограмованої клітинної смерті схематично виглядає наступним чином:

 

 

Так, рецептор, що позначається Fas, взаємодіючи з відповідним лігандом (лігандом FasL), трансмембранним білком Т-кілера, активується і запускає програму смерті клітини, інфікованої вірусом. Тим же шляхом при взаємодії з лігандом FasL на поверхні Тh-1-лімфоцитів або з антитілом до Fas-рецептору гинуть В-лімфоцити (продуценти антитіл, що несуть Fas-рецептор), які є непотрібними організму після одужання. FasL - ліганд, що відноситься до численної родини фактора некрозу пухлин (TNF - tumor necrosis factor). Це сімейство гомотримерних лігандів, крім FasL і TNFa, включає TNFb (лімфотоксин), TRAIL (Apo 2 L), CD 40 L, CD 27L, CD 30 L, OX 40 L. Fas – один з представників сімейства рецепторів TNF. Всі вони представлені трансмембранниими білками, які позаклітинними ділянками взаємодіють з тримерами лігандів-індукторів. Взаємодія рецептора і ліганда призводить до утворення кластерів рецепторних молекул і зв'язування їх внутрішньоклітинних ділянок з адаптерами. Адаптер, зв'язавшись з рецептором, вступає у взаємодію з ефекторами, поки ще неактивними попередниками протеаз з сімейства ініціаторів каспаз. Взаємодія адаптера з рецептором і ефекторів здійснюється через гомофільні білок-білкові взаємодії невеликих доменів: DD (deathdomain - домен смерті), DED (death - effector domain - домен еффектора смерті), CARD (caspase activation and recruitment domain - домен активації та рекрутування каспаз). Всі вони мають схожу структуру, містять по шість a-спіральних ділянок. Домени DD беруть участь у взаємодії рецептора Fas c адаптером FADD (Fas -associated DD - protein) і у взаємодії рецепторів TNFR 1 і DR 3 (death receptor 3) з адаптером TRADD (TNFR 1 - associated DD - protein). Домени DED беруть участь у взаємодії адаптера FADD з прокаспазами 8 і 10. Адаптер RAIDD (RIP-associated Ich-1/CED-3 homologous protein with a death domain, RIP - receptor interacting protein) зв'язується з прокаспазою-2 через CARD-домени. Найбільш вивченою і описаною є прокаспаза-8 (FLICE / MACH / Mch 5), яка рекрутується рецептором Fas через адаптeр FADD. Утворюються агрегати FasL - Fas - FADD - прокаспаза-8. Подібні агрегати, в яких відбувається активація каспаз, називаються апоптосомою, апоптозними шаперонаи, або сигнальними комплексами, що індукують смерть (DISC - death - inducing signaling complex).

Каспази – це сімейство цистеїнових протеїназ, що розщеплюють свої субстрати по залишках аспартатової кислоти. Каспази присутні в цитоплазмі у вигляді проензимів і активуються до повністю функціональних протеаз шляхом розщеплення проензимів на велику і малу субодиницю з подальшим відщепленням від них N-кінцевих доменів. Потім субодиниці збираються в тетрамер з двома активними центрами. Розщеплення прокаспаз можуть здійснювати різні протеази, в тому числі й інші каспази. По функціях, що виконують каспази їх можна розділити на дві основні групи: ініціаторні каспази (8, 9 і10) і друга група - ефекторні каспази (3, 6 і 7). Після того, як каспази з першої групи активують ефекторні каспази, процес, запущений програмою смерті, виявляється незворотнім. Розщеплення каспазами 3, 6 і 7багатьох ключових субстратів, зокрема DFF 45 / ICAD - інгібітора нуклеази DFF 40 / CAD (здійснюється каспазою 3), ламінів - ядерних цитоскелетних білків (здійснюється каспазою 6) і т.д., призводить до фрагментації ДНК і деструкції клітини.

 

 

Існують інші шляхи активації каспази-8 - за участю рецепторів TNFR 1 і DR 3. Однак ці шляхи, що включаються одним і тим же адаптером TRADD, конкурують з паралельними шляхами активації ядерних факторів транскрипції NF-к B (nuclear factor kappa B) і JNK / AP - 1 (JNK, Jun - N-кінцева кіназа, є компонентом мітоген-активованого кіназного шляху, що веде до активації фактора транскрипції AP -1), залежними від адаптерів RIP і TRAF (TNFR 1 - associatedfactor), під контролем цих факторів транскрипції знаходиться синтез білкових регуляторів, які блокують TNF - або Apo 3 L - індуковану активацію каспази-8. Існуютьнаступні шляхи передачі про- і антиапоптозних сигналів:

2. Існує шлях передачі сигналу апоптозу за участю ендоплазматичного ретикулуму (ЕР). В ЕР локалізована прокаспаза-12. Порушення внутрішньоклітинного Ca 2 + - гомеостазу додаванням тапсигаргіну або Ca 2 +-іонофорного антибіотика А23187 веде до апоптозу клітин, викликаного перетворенням прокаспази-12 в каспазу-12. ЕР-залежний апоптоз пов'язаний з хворобою Альцгеймера: кортикальні нейрони мишей, в яких є дефіцит каспази-12, стійкі до апоптозу, індукованому І-амілоїдним білком, але не до апоптозу за участю рецепторів плазматичної мембрани або мітохондріального цитохрому С.

3. Цитотоксичні лімфоцити, Т-кілери, можуть викликати апоптоз у інфікованих клітин за допомогою білка перфорину. Полімеризуючись, перфорин утворює в цитоплазматичній мембрані клітини-мішені трансмембранні канали, по яких всередину клітини надходять TNFb, гранзими (фрагментини) - суміш серинових протеаз.Істотним компонентом цієї суміші є гранзим У - протеолітичний фермент, що перетворює прокаспазу-3 в активну каспазу-3.

4. Цитохром С, який вивільняється з мітохондрій разом з цитоплазматичним фактором APAF -1 (apoptosis protease activating factor -1) бере участь в активації каспази-9. APAF -1 - білок з молекулярною масою 130 кДа, що містить CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) на N-кінці і 12 повторюваних амінокислотних WD -40 - послідовностей (WD - дипептид з триптофану і аспартату) на С-кінці, утворює комплекс з прокаспазою-9 у присутності цитохрому С іdATP або АТР. До найбільш вивчених WD-білків відноситься ? - субодиниця G-білків. З цих субодиниць збираються жорсткі, симетричні структури, на зразок віяла або пропелера. WD-повтори властиві білкам, які беруть участь у регуляції поділу та диференціювання еукаріотичних клітин, транскрипції генів, модифікації мРНК, трансмембранної передачі сигналів, злиття мембранних везикул. Серед прокаріотів WD-білки виявлені у ціанобактерій.

  APAF -1 грає роль арматури, на якій відбувається аутокаталітичий процесинг каспази-9. Існують дані, що в результаті залежного від гідролізу dATP (або АТР) конформаційної зміни APAF -1 набуває здатність пов'язувати цитохром С. Зв'язавши цитохром С, APAF -1 зазнає подальших конформаційних змін, що сприяють його олігомеризації та відкривають доступ CARD-домену APAF -1 для прокаспази -9, яка теж містить CARD-домен. Так утворюється конструкція (апоптосома) з молекулярною масою > 1300 кДа, у складі якої - не менше 8 субодиниць APAF - 1. Завдяки гомофільній CARD - CARD-взаємодії з APAF -1 в еквімолярних співвідношеннях зв'язується прокаспаза-9, а потім прокаспаза-9 зв'язує прокаспазу-3. Просторове зближення молекул прокаспази-9 на багатотімірній арматурі зAPAF-1-цитохром-С-комплексами, швидше за всього, призводить до міжмолекулярного протеолітичного процесингу прокаспази-9 з утворенням активної каспази-9. Схожий механізм існує і для активації прокаспази CED -3 у нематоди Caenorhabditis elegans (аналога прокаспази-9 ссавців). Альтернативний варіант - прокаспаза-9, зв'язавшись з апоптосомою, може стати конформацією, яка призводить до внутрішньомолекулярного процесингу (самоактивації). Зріла каспаза-9 потім розщеплює і активує прокаспазу-3. Мутантний APAF -1, позбавлений WD-40-повторів, активує прокаспазу-9, але не здатний до рекрутування і активації прокаспази-3.

Флавопротеїн AIF, будучи доданим до ізольованих ядер з клітин культури HЕLА, викликає конденсацію хроматину і фрагментацію ДНК, а при додаванні до ізольованим мітохондрій печінки щурів - вивільнення цитохрому С і каспази-9. Мікроін'єкції AIF в інтактні фібробласти щурів призводить до конденсації хроматину по периферії ядра, розриву ДНК на великі фрагменти довжиною 50 н. і більше, зниження мембранного потенціалу в мітохондріях і переходу фосфатидилсерину з внутрішнього шару цитоплазматичної мембрани в зовнішній. Жоден з цих ефектів AIF не запобігає пептидному інгібітору (Z - VAD. Fmk), який запобігає апоптозу, індукованому мікроін'єкціями цитохрому С. Ці дані показують, що AIF є одним з мітохондріальних ефекторів апоптозу у тварин, незалежно від каспаз.

Крім розглянутих компонентів, при порушенні зовнішньої мембрани мітохондрій з міжмембранного простору виділяється термолабільний фактор, що викликає необоротне перетворення ксантиндегідрогенази в ксантиноксидазу. Фактор стійкий до ряду випробуваних інгібіторів протеаз, включаючи каспази, серинові і металопротеази. Ксантиндегідрогеназа каталізує залежне від NAD + окислення ксантину до гіпоксантину і подальше окислення гіпоксантину до сечової кислоти. Ксантиноксидаза каталізує ті ж реакції, але не з NAD +, а з О₂ в якості акцептора електронів. При цьому утворюються О₂^-, Н₂О₂, а з них - й інші активні форми кисню (АФК), які руйнують мітохондрії і є потужними індукторами апоптозу. Механізми утворення АФК, звичайно, не обмежуються ксантиноксидазною реакцією. Головним джерелом АФК у клітинах є мітохондрії. Різке збільшення АФК відбувається при зростанні мембранного потенціалу в мітохондріях, коли зниженеспоживання ATФ і швидкість дихання лімітується ADP. Частина електронного потоку через дихальну ланцюг мітохондрій, що переноситься до О₂^-, досягає 1-5%. Цитоплазматична мембрана макрофагів і нейтрофілів, як уже зазначалося, містить О₂^- - генеруючу NADPH-оксидазу.

В залежності від шляху, по якому здійснюється активація каспаз, розрізняють декілька типів клітин.

Клітини типу I (зокрема, лінія лімфобластоїдних В-клітин SKW і T-клітини лінії Н9) піддаються програмованій загибелі по шляху, залежному від апоптозних рецепторів плазматичної мембрани без участі мітохондріальних білків.

Клітини типу II (наприклад, лінії Т-клітин Jurkat і СЕМ) гинуть шляхом апоптозу, залежному від мітохондріального цитохрому С. Запрограмована клітинна смерть, викликана хіміотерапевтичними сполуками, УФ- або гамма-опроміненням, очевидно, безпосередньо пов'язана з апоптозною функцією мітохондрій: клітини, позбавлені генів білка APAF -1 або каспаз-9, стійкі до хіміо- та радіаційних впливів, проте гинуть при індукції Fas-рецептора.

Деякі клітини, наприклад, клітини ембріональної нервової системи, включають механізми апоптозу, якщо вони відчувають дефіцит апоптозгальмуючих сигналів (які ще називають факторами виживання) від інших клітин. Фізіологічний сенс процесу - в елімінації надлишкових нервових клітин, конкуруючих за обмежену кількість чинників виживання. Епітеліальні клітини при відділенні від позаклітинного матриксу, який виробляє чинники виживання, теж приречені на загибель. Фактори виживання зв'язуються відповідними цитоплазматичними рецепторами, активуючи синтез гальмуючих апоптоз агентів і блокують стимулятори апоптозу. Деякі речовини (наприклад, стероїдні гормони) мають диференційований ефект на різні типи клітин - запобігають апоптоз одних типів клітин і індукують його у інших.

5. Взаємодія клітин з позаклітинним матриксом здійснюється за допомогою інтегринів. Інтегріни - велике сімейство гетеродимерних мембранних білків, які беруть участь у адгезії клітин, пов'язуючи внутрішньоклітинний цитоскелет з лігандами позаклітинного матриксу. Порушення адгезії клітин індукує апоптоз. Більшість інтегринів специфічно взаємодіє з трипептидним RGD (аргінін-гліцин-аспартат) - мотивом, що входять до складу білків позаклітинного матриксу. Розчинні низькомолекулярні RGD- , що містять пептиди є ефективними індукторами апоптозу: проникаючи в клітини, вони активують латентну каспазу-3. Ряд каспаз, включаючи каспазу-3, містить RGD - послідовність поблизу активного центру ферменту. У молекулі прокаспази ця послідовність, ймовірно, залучена у внутрішньомолекулярну взаємодію, що додає молекулі проферменту таку конформацію, при якій протеазна активність не може проявитися. Імовірно RGD-послідовність взаємодіє з послідовністю DDM (аспартат-аспартат-метіонін), локалізованої поблизу ділянки протеолітичної активації прокаспази-3. Низькомолекулярний RGD-пептид, проникаючи в клітину і вступаючи в конкурентні звязки з RGD-послідовністю прокаспази-3, витісняє її зі взаємодії з DDM-послідовністю молекул проферменту і індукує зміну їх конформації, олігомеризацію та аутопроцессинг прокаспази-3 з утворенням активної каспази-3 .

Характеристика білків В cl -2

Білки групи Bcl -2 відіграють центральну роль у виборі між життям і смертю клітини. Bcl -2 гомолог білка CED -9 у Caenorhabditis еlegans, спочатку був відкритий як протоонкоген, виявлений в результаті хромосомної транслокації t (14; 18) у разі В- клітинної лімфоми. У Bcl -2 білка впере була виявлена ​​здатність запобігати апоптозу, індукованого відсутністю ітерлейкіну-3 в культурі В-лімфоцитів людини.

З тих пір були виявлені численні гомологи Bcl -2. Це сімейство структурно подібних білків включає більше двох десятків найменувань, в тому числі продукти протоонкогенів Bcl -2 і Bcl - x, що володіють здатністю блокувати апоптоз, і пухлинний супресор Bax, що навпаки, індукує апоптоз. Сімейство Bcl -2 білків можна розділити на три основні групи:

1. Антиапоптогенні молекули, такі як Bcl -2, Bcl - xL, Bcl - w, Mcl -1, A 1 (Bfl -1) і Boo. Всі вони володіють противапоптозною активністю і мають чотири групи гомологічних послідовностей BH1, ВН2, ВН3 і ВН4 домени, хоча в деяких із них ВН4 домен відсутній.

2. Проапоптогенні молекули Bax, Bak, Bad, Mtd (Bok) і Diva мають гомологічні послідовності BH1, ВН2 і ВН3, а ВН4 домен у них відсутній.

3. Проапоптогенні білки, що містять тільки ВН3 домен: Bik, Bid, Bim, Hrk (DP 5), Blk і Bnip 3, Bnip 3 L.

Було доведено, що ВН1-3 домени відіграють важливу роль у формуванні гетеро- і гомо- димерів поміж проапоптогенними і антиапоптогенними речовинами, і клітинні рівні цих димерів можуть зіграти визначальну роль у долі клітини. Гетеродимеризація відбувається за допомогою взаємодії BH-3 домену проапоптогенного білка з гідрофобним комплексом, утвореним BH-1, BH-2 і BH-3 доменами антиапоптогенних білків. Важливо те, що домени BH-1 і BH-2, BH-4 необхідні для антиапоптогенної активності білка, в той час як BH-3 домен необхідний і достатній для проапоптогенної активності. Білок Bcl -2 один може зв'язувати, принаймні, п'ять членів вказаного сімейства, і ця його функція може бути, крім того, доповнена можливістю посттрансляційної модифікації за допомогою фосфорилювання. Близький ген, bcl - x, кодує два білки, що розрізняються сплайсингом РНК, Bcl - xL та Bcl - xS. Також як Bcl -2, білок Bcl - xL інгібує апоптоз, в той час як білок Bcl -xS негативно впливає на функцію Bcl -2 і Bcl - xL. Підвищена експресія генів цих білків може приводити до стійкості до більшості апоптичних стимулів, оскільки від цих білків залежить безліч шляхів апоптозу. Більшість антиапоптогенних членів сімейства Bcl -2 містять на С-кінцевій ділянці гідрофобну послідовність, яка необхідна для зв'язування з внутрішньоклітинними мембранами. Таким чином, проапоптогенні і антиапоптогенні члени сімейства Bcl -2, при відсутності сигналів смерті, локалізовані в різних внутрішньоклітинних компартментах. Антиапоптогенні молекули є мембранними білками, які знаходяться в мітохондрії, ЕПР і в ядерній мембрані. Проапоптогенні молекули сімейства Bcl -2 в основному локалізовані в цитозолі або пов'язані з цитоскелетом.

Механізми, за допомогою якого білки сімейства Bcl -2 регулюють мітохондріально-залежний апоптоз, залишається спірними. Нещодавно було встановлено, щоVDAC (Voltage - dependent anion channel) є одним з функціональних мішеней цих білків. Білки сімейства Bcl -2, такі як Bax, Bak, Bcl -2 і Bcl - XL можуть взаємодіяти з двома компонентами РТ (permeability transition) пор, з VDAC, локалізованим на зовнішній мітохондріальній мембрані, і з ANT (adenine nucleotide translocator), на внутрішній мембрані. Bcl -2 і Bcl - XL закривають VDAC-канали, через які здійснюється викид цитохрому С і / або AIF. Bax і Bak, що знаходяться в нормі в певних компартментах цитоплазми, при дії апоптогенних сигналів переміщаються в мітохондріальні мембрани, де вони, взаємодіючи з інтегральним білком зовнішньої мітохондріальної мембрани VDAC, стимулюють відкриття каналу. Крім того, Bax утворює гетеромерні комлекси з білками Bcl -2, Bcl - x, що, можливо, відкриває закриті до цього канали. Таким чином, баланс між про- та антиапоптогенними членами сімейства Bcl -2 відіграє вирішальну роль у долі клітини.