11.6.4. Использование клеток плода, циркулирующих в крови матери, для пренатальной диагностики наследственных болезней.

Новый неинвазивный подход в пренатальной диагностике наследственных болезней – выделение и анализ клеток плода, присутствующих в крови матери. Во время беременности происходит трансплацентарный двухсторонний перенос не только растворенных в крови веществ, но и клеток. Первое упоминание об обнаружении клеток трофобласта в легочной ткани при патологоанатомическом исследовании беременных женщин, умерших от эклампсии, относится к 1893 г. Впервые клетки с ХУ-кариотипом в культуре лимфоцитов крови женщин, беременных плодом мужского пола, были обнаружены J.Walknovska и соавт в 1969 г. Процесс двухстороннего трансплацентарного переноса плазмы и форменных элементов крови наблюдается с ранних сроков нормальной беременности, что способствует развитию толерантности материнского организма по отношению к плоду. Присутствие малого количества клеток плода в крови женщины во время беременности называется «микрохимеризмом». Вероятно, лимфоцитарный микрохимеризм сохраняется в организме рожавших женщин на протяжении всей жизни. Проникновение клеток плода значительно увеличивается при травме плаценты или патологическом течении беременности: угрозе ее прерывания, плодно-материнской геморрагии, эктопической и многоплодной беременности. Существенно увеличивается концентрация клеток плода в крови женщин, беременных плодом с трисомией 21 и другими хромосомными синдромами.

В крови беременных женщин присутствуют клетки трофобласта, лимфоциты, гранулоциты, эритробласты и тромбоциты плода. Все ядросодержащие клетки могут быть источником ДНК плода и потенциальными клетками-кандидатами для пренатального исследования с помощью FISH-метода или ПЦР.

В настоящее время наибольшие успехи в пренатальной диагностике получены при выделении эритробластов плода. Описаны успешные случаи пренатальной диагностики пола у плода, трисомий по 21 и 18 хромосоме, β-талассемии и других наследственных заболеваний.

Однако, концентрация клеток плода в крови беременной чрезвычайно мала. Например, D. Bianchi и соавт. (1997), используя высокочувствительный метод количественной ПЦР, нашли, что количество амплифицированных Y-специфических последовательностей, выделенных из 16 мл материнской крови, эквивалентно в среднем 19 клеткам плода (или 1 клетка на 1мл крови). Даже использование современных методов сортировки и концентрации клеток не всегда позволяет выделить клетки плода в достаточном для пренатальной диагностики количестве. Кроме того, они всегда оказываются «загрязненными» клетками матери. Поэтому в настоящее время метод исследования клеток плода, выделенных из крови беременной женщины, не дают стабильных надежных результатов. Остается высоким процент диагностических ошибок. Метод следует рассматривать как перспективный, но требующий доработки и, возможно, усовершенствований с использованием новых технологий.

11.7. Методы диагностики наследственной патологии в системе современных репродуктивных технологий

11.7.1. Доимплантационная (преимплантационная) диагностика. В настоящее время в связи с развитие методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) широкое распространение получает доимплантационная диагностика наследственных заболеваний. Цель доимплантационной диагностики – не допустить перенос и имплантацию эмбрионов с серьезными генетическими заболеваниями. Такая диагностика предлагается супружеским парам, имеющим высокий риск рождения детей с хромосомными болезнями (связанный с возрастом матери, с носительством сбалансированных хромосомных мутаций) или с моногенными болезнями.

Идея доимплантационной диагностики возникла давно. Еще в 1967 г. R. Edwards и R. Gardner успешно определили пол у эмбрионов кролика, находящихся на стадии бластоцисты, и затем перенесли их в полость матки. Однако, у человека методика стала успешно использоваться в начале 90-х годов, когда стало возможным с помощью ПЦР, а затем FISH-метода определять мутации в единичных клетка.

Суть метода заключается в следующем. После стимуляции ХГЧ гиперовуляции у женщин получают несколько овоцитов, проводят оплодотворение in vitro (экстракорпоральное оплодотворение). На 3-й день у эмбрионов на стадии 5-8 клеток с помощью микроманипулятора отделяют бластомер. Бластомер исследуют с помощью FISH или ПЦР. В последующем имплантируют генетически полноценные эмбрионы.

Известно, что большинство случаев анеуплоидий являются следствием нерасхождения хромосом во время мейоза при овогенезе. Поэтому для исследования может быть получено полярное тельце (первое и второе). Такая преимплантационная диагностика особенно показана женщинам старше 35 лет, треть овоцитов которых может иметь хромосомный дисбаланс.

Для диагностики хромосомных синдромов наиболее надежным методом исследования бластомеров или полярных телец является FISH, в котором используются ДНК-зонды для одновременного определения хромосом 13, 18, 21, Х,Y. С помощью специальных зондов может быть проведена диагностика хромосомных аберраций (если один из родителей является носителем сбалансированной хромосомной аберрации). Анализ кариотипа одного бластомера (или полярного тельца), не исключает, однако, возможность мозаичной формы хромосомной болезни.

Если родители имеют риск рождения ребенка с моногенным заболеванием, то бластомер исследуют с помощью ПЦР. В настоящее время проводится доимплантационная диагностика муковисцидоза, болезни Тея-Сакса, гемофилии А и В, серповидно-клеточной анемии, талассемии, мышечной дистрофии Дюшенна, синдрома ломкой Х-хромосомы, синдрома Марфана, хореи Гентингтона и др. заболеваний.

Пока проводится анализ клетки, зародыш продолжает развиваться в искусственных условиях. Зародыш может быть заморожен в жидком азоте. Половые клетки человека и ранние эмбрионы после размораживания хорошо сохраняют жизнеспособность. Подсадка после заморозки может быть сделана во время любого другого овариального цикла, не обязательно в тот месяц, когда взята яйцеклетка. Имплантируют только генетически полноценные эмбрионы.

11.7.2. Генетические исследования доноров спермы, которая используется для искусственного осеменения. В настоящее время считают целесообразным проведение тестирования доноров спермы на гетерозиготное носительство генов наиболее распространенных моногенных заболеваний. К числу таких заболеваний относятся муковисцидоз, фенилкетонурия, спинальная амиотрофия (болезнь Верднига-Гофмана), адреногенитальный синдром. Целесообразно также выявление мутации в гене Сх26, являющейся причиной более половины всех случаев наследственной несиндромальной глухоты.