2.3 Микробиологические и генетические методы исследования

2.3.1Забор материала

Забор материала из пародонтальных карманов пациентов для микробиологических исследований производили с помощью стерильных бумажных эндодонтических абсорберов Absorbent Paper Points, фирмы Euronda (размер №25), которые вводили в пародонтальные карманы на 10 секунд с обеспечением минимального контакта с атмосферным воздухом (после забора материала эндодонтические абсорберы Absorbent Paper Points, немедленно помещались в пробирку). Забранный материал помещали в стерильные пластмассовые пробирки типа Eppendorf, находящиеся в специальном устройстве для охлаждения. До взятия материала пациенты не применяли никаких лекарственных полосканий и не чистили зубы.

2.3.2 Культуральные среды и условия роста

Культивирование факультативных анаэробов проводили на 1.5% плотной среде THB (Difco, США) с добавлением 0.5% дрожжевого экстракта (Helicon, Россия) и 5% крови барана при температуре 37°С и 5% СО₂ в течение 18 часов.

2.3.3 Выделение чистой культуры

Рассев исходного биологического материала производили методом истощающего штриха (по Дригальски). Метод истощающего штриха предполагает высев культуры на поверхность агаризованной среды в чашку Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде (рис.2.3.1, А). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рис.2.3.1, Б). Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рис.2.3.1), а после очередной стерилизации – в направлении Г (рис.2.3.1). Чашку помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии (http://studopedia.ru/7_23671_metodi-videleniya-chistoy-kulturi.html).

Рис.2.3.1 Метод истощающего штриха

2.3.4 Выделение тотальной днк из исходного биологического материала

Тотальную ДНК из исходного биологического материала выделяли с помощью тест-системы для ПЦР «ДНК-экспресс» (Литех, Россия) в соответствии с инструкцией.

2.3.5 Конструирование олигонуклеотидных праймеров

Конструирование, анализ олигонуклеотидных праймеров и определение температуры плавления праймеров осуществляли с помощью компьютерных программ Primer 3 и OLIGO 4.0 (Таблица 2.3.1).

Таблица 2.3.1

Олигонуклеотидные праймеры S.sanguinis и S.gordonii

	Название	5’→3’	Тотж.	Размер фрагмента (п.н.)
	S.sanguinis
1	Sang1	GGATAGTGGCTCAGGGCAGCCAGTT	59,7	313
2	Sang2	GAACAGTTGCTGGACTTGCTTGTC
	S.gordonii
3	Gord1	TGCTTTTCCACTCGACTCTCTC	55,4	598
4	Gord2	TCCTGGAGCAAATTGATCTTGT
5	UniBF	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	55,4
6	UniBR	GGACTACCAGGGTATCTAAT	51,9