2. Экспериментальная часть

1. Объекты и методы исследования

1. Объекты исследования

Объектами исследования служили промышленные образцы растительного сырья, заготавливаемые фирмами-изготовителями, которые имели соответствующие сертификаты качества и безопасности на выпускаемую продукцию, документы о регистрации растительного сырья на территории РФ, что гарантирует стандартную процедуру получения сырья. Качество и безопасность растительного сырья соответствовали гигиеническим нормативам, установленным СанПиН 2.3.2.560-96 «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов». К таким видам сырья относятся:

- корневища куркумы длинной - Rhizomata Сurситае longae (страна-заготовитель: Индия, Китай, Вьетнам);

- плоды кмина тминового - Fructus Cumini cymini (страна — заготовитель:

Марокко, Узбекистан);

- надземные части душицы - Origanum vulgare L., семейство Lamiaceae), чабреца (Thymus serpyllum L., семейство Lamiaceae) и тысячелистника (Achillea millefolium Z., семейство Asteraceae), (страна заготовитель: Россия);

- плоды перца красного – Capsicum annum L. (страна заготовитель: Индия)

- плоды перца черного – Piper nigrum L. (страна заготовитель: Въетнам)

- плоды перца душистого – Pimenta officinalis Lindl. (страна заготовитель: Вьетнам),

разрешенные к применению в пищевой промышленности, характеризующиеся комплексным физиологическим воздействием на организм человека.

Использовали штаммы тест-культур микроорганизмов: Pseudomonas aeruginosa S., Bacillus subtilis E., Staphylococcus aureus R., Escherichia coli M., Rhizopus stolonifer E.

2. Методы исследования

1. Методика получения водно-спиртовых экстрактов пряно-ароматических растений и эфирных масел

Для приготовления водно-спиртовых экстрактов из сухого пряно-ароматического сырья предварительно готовили водно-спиртовые смеси (этиловый спирт : питьевая вода, 7:3). Для этой цели использовали спирт этиловый ректификат по ГОСТ Р51625-2000 марки «Экстра» и воду питьевую, подготовленную.

Измельченное сухое растительное сырье, помещенное в тару из темного стекла, заливали теплым (50 °С) растворителем и термостатировали при температуре 80 °С в течение 30 мин. Соотношение сырье – экстрагент составляло 1:7.

После термостатирования герметично укупоренную тару со смесью помещали в защищенное от света место и выдерживали 7 сут., после чего растительный шрот отделяли, отжималии проводили его повторную экстракцию. Первую и вторую фракции экстракторов объединяли, отстаивали и отфильтровывали.

Эфирные масла получали методом гидродистилляции из воздушно-сухого сырья /27/. Время перегонки составляло от 3 до 4 часов. Эфирное масло отделяли от воды эфиром диэтиловым и в течение 12 часов высушивали над фосфора (V) оксидом в эксикаторе.

2. Методы исследования антимикробной активности

Противомикробные исследования проведены известными доступными методами: метод дисков или прямой диффузии в агаровую среду – метод ДЗЗР (диаметра зоны задержки роста микроорганизмов), метод подавления роста колоний на питательной среде живых колониеобразующих микробных клеток (метод КОЕ), бактерицидную активность эфирных масел определяли методом серийных разведений в 0,5 мл питательного бульона (методом колодцев) с высевом тест-культур на чашки с мясопептонным агаром /27, 32/.

Чашки с агаровой средой засевались 18-часовой бульонной культурой микроорганизмов. Для количественной оценки действия растительного материала засев чашек производился бактериальной эмульсией, содержащей в 0,1 мл ~ 500 микробных тел. Бактериальную смесь приготовляли путем последовательных разведений бульонной культуры в физиологическом растворе. Для этого мерной однокубиковой пипеткой набирали 0,5 мл бульонной культуры и переносили в пробирку, содержащую 4,5 мл физиологического раствора (первое разведение). Полученная бактериальная смесь тщательно перемешивалась путем нескольких вдуваний и выдуваний пипеткой. Далее из этой пробирки набирали по 0,5 мл бульонной и переносили в следующую пробирку с 4,5 мл физиологического раствора (2-е разведение) и т.д. до получения нужной концентрации. Каждое разведение производили отдельной пипеткой.

Исходную бактериальную эмульсию подводили к стандарту. Затем взвесь рядом «последующих» разведений в физиологическом растворе доводили до нужной концентрации. Диаметр дисков составлял 10 мм.

Исследование проводили с водно-спиртовыми экстрактами и эфирными маслами из изучаемых растений. Антимикробную активность устанавливали в отношении указанного набора индикаторных штаммов микроорганизмов методом культивирования микробов на среде с добавлением фитосубстанции в сравнении с контролем.

Из исследуемых субстанций готовили различные разведения в стерильном расплавленном и остуженном до 50 °С питательном агаре. Содержимое после перемешивания заливали в стерильные чашки Петри и оставляли при комнатной температуре, после застывания агара чашки делили на секторы. Каждый сектор засевали штриховым методом взвесью суточных культур, содержащей 100 млн. микробных тел в 1 мл, в количестве одной бактериальной петли. Контролем являлись посевы тех же бактерий на питательные среды, не содержащие испытуемых препаратов. Посевы инкубировали в термостате при температуре +37 °С. Результаты эксперимента учитывали через 24, 48 и 72 часа. При этом регистрировали интенсивность роста колоний микроорганизмов (сильный рост, слабый рост) или его отсутствие. Антимикробную активность выражали в мкг/мл в пересчете на действующие вещества и воздушно-сухое сырье, из которого приготовлено извлечение.