42. Этапы трансляции (инициация , элонгация, терминация) и их характеристика

Трансляция (от лат. translatio — перевод) — процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационной (матричной) РНК (иРНК, мРНК), осуществляемый рибосомой.

Механизм

Синтез белка является основой жизнедеятельности клетки. Для осуществления этого процесса в клетках всех без исключения организмов имеются специальные органеллы — рибосомы. Рибосомы представляют собой рибонуклеопротеидные комплексы, построенные из 2 субъединиц: большой и малой. Функция рибосом заключается в узнавании трёхбуквенных (трехнуклеотидных) кодонов мРНК, сопоставлении им соответствующих антикодонов тРНК, несущих аминокислоты, и присоединении этих аминокислот к растущей белковой цепи. Двигаясь вдоль молекулы мРНК, рибосома синтезирует белок в соответствии с информацией, заложенной в молекуле мРНК.

Для узнавания аминокислот в клетке имеются специальные «адаптеры», молекулы транспортной РНК (тРНК). Эти молекулы, имеющие форму клеверного листа, имеют участок (антикодон), комплементарный кодону мРНК, а также другой участок, к которому присоединяется аминокислота, соответствующая этому кодону. Присоединение аминокислот к тРНК осуществляется в энерго-зависимой реакции ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами, а получившаяся молекула называется аминоацил-тРНК. Таким образом, специфичность трансляции определяется взаимодействием между кодоном мРНК и антикодоном тРНК, а также специфичностью аминоацил-тРНК-синтетаз, присоединяющих аминокислоты строго к соответствующим им тРНК (например, кодону GGU будет соответствовать тРНК, содержащая антикодон CCA, а к этой тРНК будет присоединяться только аминокислота глицин).

Механизмы трансляции прокариот и эукариот существенно отличаются, поэтому многие вещества, подавляющие прокариотическую трансляцию, в значительно меньшей степени действуют на трансляцию высших организмов, что позволяет использовать их в медицинской практике как антибактериальные средства безопасные для организма млекопитающих.

Процесс трансляции разделяют на

инициацию — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза.

элонгацию — собственно синтез белка.

терминацию — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта.

Рамка считывания

Поскольку каждый кодон содержит три нуклеотида, один и тот же генетический текст можно прочитать тремя разными способами (начиная с первого, второго и третьего нуклеотидов), то есть в трех разных рамках считывания. За некоторыми интересными исключениями, значимой является информация, закодированная только в одной рамке считывания. По этой причине крайне важным для синтеза белка рибосомой является её правильное позиционирование на стартовом AUG-кодоне — инициация трансляции.

Инициация

Синтез белка в большинстве случаев начинается с AUG-кодона, кодирующего метионин. Этот кодон обычно называют стартовым или инициаторным. Инициация трансляции предусматривает узнавание рибосомой этого кодона и привлечение инициаторной аминоацил-тРНК. Для инициации трансляции необходимо также наличие определённых нуклеотидных последовательностей в районе стартового кодона (последовательность Шайна — Дальгарно у прокариот и последовательность Козак у эукариот). Немаловажная роль в защите 5'-конца мРНК принадлежит 5'-кэпу. Существование последовательности, отличающей стартовый AUG от внутренних совершенно необходимо, так как в противном случае инициация синтеза белка происходила бы хаотично на всех AUG-кодонах.

Процесс инициации обеспечивается специальными белками — факторами инициации (англ. initiation factors, IF; инициаторные факторы эукариот обозначают eIF, от англ. eukaryotes).

Механизмы инициации трансляции у про- и эукариот существенно отличаются: прокариотические рибосомы потенциально способны находить стартовый AUG и инициировать синтез на любых участках мРНК, в то время как эукариотические рибосомы обычно присоединяются к мРНК в области кэпа и сканируют её в поисках стартового кодона.

У прокариот

Малая рибосомная субъединица (30S) прокариот, если она не вовлечена в данный момент в трансляцию, существует в комплексе с инициаторными факторами IF1, IF3, и, в некоторых случаях, IF2. Рассмотрим основные функции этих белков:

IF3, связанный с 30S-субъединицей, предотвращает ассоциацию с большой (50S) субъединицей рибосомы, тем самым сохраняя её свободное состояние до связывания с матричной РНК. Этот белок также принимает участие в связывании мРНК и тРНК, а также IF2.

IF2 взаимодействует с тРНК, а также обладает способностью расщеплять ГТФ.

IF1 является, по-видимому, не обязательным фактором (у некоторых видов он отсутствует) повышающим сродство малой субчастицы к IF2 и IF3

Комплекс 30S субчастицы с инициаторными факторами способен узнавать специальные последовательности мРНК, так называемые участки связывания рибосомы (англ. RBS, ribosome-binding site). Эти участки содержат, во-первых, инициаторный AUG, и, во-вторых, специальную последовательность Шайна — Дальгарно с которой комплементарно связывается рибосомная 16S РНК. Последовательность Шайна — Дальгарно служит для того, чтобы отличать инициаторный AUG от внутренних кодонов, кодирующих метионин. После того, как 30S-субъединица связалась с мРНК к ней привлекается инициаторная аминоацил-тРНК и IF2, если они ещё не были включены в комплекс. Затем присоединяется 50S-субчастица, происходит гидролиз ГТФ и диссоциация инициаторных факторов. Собранная рибосома начинает синтезировать полипептидную цепь.

У эукариот

У эукариот существуют два основных механизма нахождения рибосомой стартового AUG: кэп-зависимый (сканирующий) и кэп-независимый (внутренняя инициация).

При сканирующем механизме рибосома (точнее, её малая субъединица) садится на 5'-конец мРНК в области кэпа и двигается вдоль молекулы мРНК, «сканируя» один кодон за другим, пока не наткнётся на инициаторный AUG. Для привлечения рибосомы к 5'-концу мРНК требуется специальная структура, кэп — 7-метилгуанин, прикреплённый к 5'-концевому нуклеотиду мРНК.

При механизме внутренней инициации, называемом у эукариот также IRES-зависимым механизмом, рибосома садится на внутренний участок мРНК, называемый IRES (англ. Internal Ribosomal Entry Site, участок внутренней посадки рибосомы) — участок мРНК, обладающий выраженной вторичной структурой, позволяющей ему направлять рибосомы на стартовый AUG. По IRES-зависимому механизму инициируется синтез лишь на небольшой части клеточных мРНК, а также на РНК некоторых вирусов.

В дополнение к основным механизмам инициации, при наличии перед стартовым кодоном поли(А)-лидера (например, в мРНК вирусов семейства оспы) реализуется нестандартный механизм инициации. В этом случае инициаторный комплекс не содержит факторовe IF3 и eIF4F, и после сборки на 5'-нетранслируемой области осуществляет не последовательное сканирование мРНК, а т.н. АТФ-независимое "бесфазное блуждание". При этом инициация протекает значительно быстрее, чем в случае работы по классическому сканирующему механизму.

Также у эукариот возможна реинициация трансляции, когда после окончания трансляции рибосома с белковыми факторами не диссоциирует от мРНК, а перескакивает с 3' на 5' конец мРНК и начинает инициацию ещё раз. Это возможно благодаря т.н. циклизации мРНК в цитоплазме, то есть физическому сближению старт- и стоп-кодонов с помощью специальных белков.

Кэп-зависимый механизм

В отличие от прокариот, инициация трансляции у которых обеспечивается лишь тремя белковыми факторами, трансляция подавляющего большинства мРНК эукариот, содержащих 5'-кэп [m7G(5')ppp(5')N] и 3' поли(А)-хвост, требует участия, по крайней мере, 13 общих эукариотических факторов инициации (eIF), представленных 31 полипептидом. Инициация трансляции включает события между диссоциацией рибосомы во время терминации в предыдущем цикле трансляции и сборкой рибосомы, готовой к элонгации, на старт-кодоне мРНК. Во время инициации аппарат трансляции решает следующие задачи:

диссоциация и антиассоциация рибосомных субъединиц;

выбор инициаторной метионил-тРНК (Met-tRNAiMet);

связывание 5'-кэпа, связывание поли(А), сканирование;

выбор правильного старт-кодона;

объединение рибосомных субъединиц на старт-кодоне

Диссоциация и антиассоциация субъединиц рибосом

Диссоциация рибосомных субъединиц в конце терминации — активный процесс, в котором участвуют eIF, а также факторы элонгации и терминации. Антиассоциация уже диссоциированных субъединиц обеспечивается eIF и служит для предотвращения преждевременного объединения рибосомных субъединиц. Главная роль в выполнении этой задачи принадлежит eIF3, мультисубъединичному фактору, состоящему из 13 различных субъединиц (общей молекулярной массой 800 кДа) у млекопитающих, 11 субъединиц у растений и шести субъединиц у дрожжей Saccharomyces cerevisiae eIF3 связывается с 40S субъединицей рибосомы (40S) посредством своей j-субъединицы, которая, в свою очередь, взаимодействует с «каркасной» (scaffolding) b-субъединицей и предотвращает ассоциацию 40S с 60S рибосомной субъединицей (60S). Эти активности eIF3 зависят от его взаимодействия с eIF1 и тройственным комплексом eIF2/GTP/Met-tRNAiMet. Связывание eIF1 с 40S является кооперативным с eIF3, так же как и связывание eIF1 с eIF1А (гомологом бактериального IF1). Таким образом, eIF1А, вероятно, также участвует в антиассоциации, по крайней мере, непрямым образом.

Селекция инициаторной метионил-тРНК (Met-tRNAiMet)

Этот этап включает в себя следующие процессы:

узнавание и метионилирование tRNAiMet специфичной метионил-тРНК-синтетазой;

дискриминацию против Met-tRNAiMet эукариотическими факторами элонгации;

дискриминацию против неметионилированной или неправильно аминоацилированной tRNAiMet eIF;

дискриминацию против элонгаторных тРНК eIF.

В ходе процесса (а), метионил-тРНК-синтетаза взаимодействует как с акцепторным концом тРНК, так и с антикодоном.

Процесс (б) у растений и дрожжей осуществляется с помощью посттранскрипционной модификации tRNAiMet, которая делает её отличной от элонгаторной метионин-специфичной тРНК с помощью присоединения 2'-О-фосфорибозила к рибозе нуклеотида А64. У позвоночных процесс (б) осуществляется путём дискриминации между специфическими особенностями нуклеотидных последовательностей tRNAiMet и элонгаторной метиониновой тРНК.

Элонгация

В процессе наращивания полипептидной цепи принимают участие два белковых фактора элонгации. Первый (EF1a у эукариот, EF-Tu — у прокариот) переносит аминоацилированную («заряженную» аминокислотой) тРНК в А (аминоацил)-сайт рибосомы. Рибосома катализирует перенос пептида, связанного с тРНК в Р-сайте, в А-сайт и образование пептидной связи с находящимся там аминокислотным остатком. Таким образом растущий пептид удлиняется на один аминокислотный остаток. Затем второй белок (EF2 у эукариот, EF-G — у прокариот) катализирует так называемую транслокацию. Транслокация — перемещение рибосомы по мРНК на один триплет (примерно 20 ангстрем), в результате которого пептидил-тРНК оказывается вновь в Р-сайте, а «пустая» тРНК из P-сайта переходит в Е-сайт (от слова exit). тРНК из E-сайта диссоциирует спонтанно, после чего рибосома готова к новому циклу элонгации.

Терминация

Терминация — окончание синтеза белка, осуществляется, когда в А-сайте рибосомы оказывается один из стоп- кодонов — UAG, UAA, UGA. Из-за отсутствия тРНК , соответствующих этим кодонам, пептидил-тРНК остаётся связанной с Р-сайтом рибосомы. Здесь в действие вступают специфические белки RF1 или RF2, которые катализируют отсоединение полипептидной цепи от мРНК, а также RF3, который вызывает диссоциацию мРНК из рибосомы. RF1 узнаёт в А-участке UAA или UAG; RF-2 — UAA или UGA. С UAA терминация эффективнее, чем с другими стоп-кодонами.

Компартментализация у эукариот

В отличие от прокариот, у которых биосинтез белка происходит непосредственно во время транскрипции соответствующих мРНК, для эукариот характерна строгая компартментализация всех процессов, происходящих во время биосинтеза белка, в том числе и компартментализация трансляции.

Трансляция мРНК секреторных и мембранных белков (обычно они составляют 3—15 % от всех синтезируемых клеткой белков) происходит на рибосомах, связанных с гранулярной эндоплазматической сеткой. По классическим представлениям, ещё 35—45 % рибосом связаны с цитоскелетом, а оставшиеся 20—40 % рибосом находятся в несвязанном состоянии в цитозоле. Однако высказываются предположения, что свободные рибосомы являются артефактом, и в клетке они связаны с так называемой микротрабекулярной решеткой, образованной особым типом филаментов. Впрочем, по другим данным, само существование микротрабекулярной решетки ставится под сомнение, так что вопрос о существовании активных несвязанных рибосом остаётся открытым.

В настоящее время высказывается гипотеза, что трансляция у эукариот происходит не во всей цитоплазме клетки, а в отдельных областях цитоплазмы, условно называемых «трансляционными компартментами». Предположительно, в состав трансляционного компартмента входят следующие структуры:

рибосомы с присоединенными к ней белковыми факторами, матричной и транспортными РНК;

так называемые кодосомы — сложные белковые комплексы, в которые входят 7-9 аминоацил-тРНК синтетаз, пирофосфатаза, циклические нуклеотиды, ионы магния и липиды;

eEF1H — тяжёлая (англ. heavy), или полная, форма фактора элонгации 1. Он содержит 4 фактора элонгации (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ, eEF1Bγ).

Компартментализация трансляции обеспечивает высокую скорость биосинтеза белка и широкие возможности регуляции этого процесса.

Или