Определение числа бактерий методом световой микроскопии

(метод Германова с окраской бактериальных клеток раствором карболового эритрозина

Подсчет микроорганизмов проводят на мембранных фильтрах «Синпор» № 7 производства ЧССР с величиной пор 0,3 ± 0,04 мкм. Диаметр фильтрующей поверхности составляет 1 см².

На краях мембранных фильтров делают карандашом отметку с указанием номера, затем фильтры перед окрашиванием освобождают от наполнителя путем многократного кипячения в свежих порциях дистиллированной воды на слабом огне (до исчезновения специфического запаха).

Микроскопический препарат готовят путем фильтрования пробы воды объемом 1 см³ через мембранный фильтр № 7. Для равномерного распределения бактерий на площади фильтра до начала фильтрования приливают 10 см³ фильтрованной воды.

Фильтр окрашивают раствором 5%-ногокарболового эритрозина и оставляют на 18 часов.

Окраску производят следующим образом: в чашку Петри помещают фильтровальную бумагу, увлажненную красителем, на нее нижней стороной укладывают фильтры с осевшими на них бактериями и закрывают крышкой. По окончании окрашивания краску отмывают, перекладывая фильтры на фильтровальной бумаге, смоченной стерильной водой, пока фильтр перестанет окрашивать бумагу.

После отмывания фильтр высушивают. Площадь фильтра с взвесью должна быть розовой, а края – почти бесцветными.

После высушивания фильтр помещают на предметное стекло между слоями иммерсионного масла, накрывают покровным стеклом. На него наносят каплю иммерсионного масла и просматривают под микроскопом МИКМЕД-1 с объективом х90 при окуляре с сетчатым микрометром (х7).

Подсчитывают число бактерий в 20 квадратах по диагонали, в 20 полях зрения. Подсчет производят на фильтрах, содержащих не менее 2–5 и не более 15–25 бактерий в каждом маленьком квадрате. Подсчет производят по формуле (Романенко, Кузнецов, 1974):

,

где х – количество бактерий в 1 см³ пробы;

е – площадь фильтра (πr²), мм;

10⁶ – переводной коэффициент (мм² в мкм²);

д – сумма подсчитанных бактерий в полях зрения;

а – площадь окулярного сетчатого микрометра при том же увеличении, мкм²;

ж – объем профильтрованной пробы, см³;

г – число полей зрения на площади а.

Затем производили пересчет бактерий на объем исследуемой суспензии.

Х’ = х· V,

где: х – количество бактерий в 1 см³;

V – объем смывной жидкости, см³.

Лабораторная работа 2 Методы определения численности бактерий в водных экосистемах, способных к росту на питательных средах

По способности к росту при различных концентрациях органических субстратов гетеротрофные микроорганизмы можно разделить на две группы, одна из которых обладает способностью к росту при очень низком содержании субстрата в среде - олиготрофные бактерий, а вторая - при высоком – евтрофные. При этом микроорганизмы второй группы не проявляют активности, но и не погибают при низких концентрациях органических субстратов в среде.

Для учета численности евтрофных и олиготрофных бактерий применяют различные по составу среды.

Для учета евтрофных бактерий используют среды, содержащие 2 и более граммов органического углерода в литре.

Для выделения вторых используются питательные среды, содержащие от менее 1 мг до 50 мг органического вещества в литре.

Четких границ между группами евтрофных и олиготрофных бактерий, основываясь только на их способности к росту на средах с высоким или низким содержанием сложных органических веществ (пептона, дрожжевого экстракта и т.д.), провести, по-видимому, невозможно. Для учета евтрофных и олиготрофных бактерий обычно используют плотные (агаризованные или силикагелевые), либо жидкие среды.

Определение наиболее вероятного числа евтрофных и олиготрофных микроорганизмов методом предельных разведений

Для учёта численности как евтрофных, так и олиготрофных бактерий, можно использовать метод предельных разведений. Этот метод является наиболее распространенным методом учета численности бактерий, способных к росту на питательных средах, который иногда называют методом наиболее вероятного числа. Приготовленную жидкую питательную среду разливают в пробирки с заранее подобранными ватными пробками по 9 мл в каждую. После разлива пробирки стерилизуют в автоклаве.

Для учета численности евтрофных бактерий в морских водах используют модифицированную среду Зобелла следующего состава (г): пептон - 5,0; КН₂РО₄·3Н₂О - 0,084; FeSO₄·7H₂O - 0,185; NaCl - 24,0; MgSO₄·7H₂O - 1,0; KCl - 0,7; дрожжевой экстракт - 1,0; вода дистиллированная - 1 л.

Для учета олиготрофных бактерий используют моди­фицированную среду ММС следующего состава (г): NaCl - 7,0; MgSO₄·7Н₂О - 1,0; КС1-0,7; К₇НРО₄-2,0; Na₂HPО₄ - 3,0; NH₄NО₃ - 1,0; вода дистиллированная - 1,0 л. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляют 50 мг/л дрожжевого экстракта.

Время инкубации проб воды зависит от состава среды и исходной численности микроорганизмов в пробе воды. Как правило, для евтрофных бактерий время инкубации составляет не более 7 суток, а для олиготрофных около месяца. Пробирки с разведениями инкубируют при комнатной температуре, не выше 20С. В зимний период желательно проверять посевы на присутствие в них психрофильных форм бактерий. Поэтому в этом случае делают два посева из одной пробы воды, один из которых инкубируют при 5-10С, а второй при 20С .

После инкубации отмечают появление признаков роста: образование мути, пленки или осадка. При использовании этого метода делается допущение, что для появления признаков роста на питательной среде достаточно попадания в нее одной бактериальной клетки. Для расчета численности микроорганизмов в пробе пользовались таблицами Мак-Креди, построенными на основе методов вариационной статистики. Количество бактерий пересчитывали на 1 мл пробы.