Методы выделения нитрифицирующих бактерий

Под нитрификацией понимают процессы окисления аммиака до нитрита и нитрата. Вызывают их нитрифицирующие бактерии. Энергию, выделяющуюся при окислении аммиака и нитрита, нитрификаторы используют для ассимиляции диоксида углерода. Бактерии, осуществляющие данный процесс, относятся к хемолитоавтотрофам и представляют собой облигатных аэробов.

Порядок выполнения работы:

Пробы воды засевают в жидкие питательные среды Виноградского, разведенные в 10 раз, и инкубируют при температуре 20-25 °С. Развитие нитрифицирующих бактерий наблюдают через 2-3 недели и определяют по появлению нитратов и исчезновению аммиака. Питательные среды оставались прозрачными, а нитрифицирующие бактерии сосредотачивались в осадке на кристаллах углекислого кальция или фосфорно-аммонийно-магнезиальной соли.

Для выделения чистой культуры из среды с накопительной культурой производят ряд последовательных пересевов на среды того же состава. Посевы термостатируют при температуре 20-25 °С в течение 2-3 недель. Из полученных культур отбирают те, которые осуществляли процесс нитрификации наиболее активно. Перед началом выделения культуры растворяют осадок углекислого кальция, на котором находилась в прикрепленном состоянии основная масса жизнедеятельных клеток Nitrosomonas и Nitrobacter. Из прозрачного раствора делают ряд разведений в стерильные среды Виноградского. Путем многократных пересевов накопительных культур избавлялись от банальных форм сопутствующих микроорганизмов, и в культуре оставалась устойчивая ассоциация нитрификаторов.

Оценка результатов. Культуру подвергают микроскопическому контролю. Затем делают проверку чистоты культуры на РПА, картофельном агаре, сусло-агаре с мелом и без мела, крахмало-аммиачном агаре, среде Гетчинсона для целлюлозоразлагающих бактерий, среде Калиненко с лимоннокислым кальцием и агаре Эшби. Отсутствие роста на этих средах указывает на чистоту культуры Nitrosomonas и Nitrobacter.

Лабораторная работа 4 Методы идентификации бактерий различных физиологических групп микробиальных сообществ водных экосистем

Идентификацию бактерий проводят по культуральным, морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, которые изучают пользуясь определителем бактерий Берджи. Идентификация микроорганизмов начинают с изучения их культуральных свойств на агаризированных средах и морфологии в мазках приготовленных из колоний, окрашенных по Грамму. Колонии, выросшие в чашках, характеризуют и описывают, учитывая размер, рельеф, контур края колоний, поверхность колонии, цвет колонии, консистенция колонии.

Изучение морфологических свойств микроорганизмов

Определение типа клеточной стенки. Грамотрицательные микроорганизмы образуют с генциановым кристаллическим или метиловым фиолетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, принимая розовый цвет. Грамположительные бактерии окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.

Определение спорообразования. Ha высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5 % раствора соляной кислоты и подогревали 1–2 мин над пламенем горелки до закипания, после чего остатки кислоты сливали. Остывший препарат промывают водой, подсушивают и фиксируют на огне. Окрашивают фуксином Циля с подогреванием до появления паров. Обесцвечивают 5 %-м раствором серной кислоты в течение 1–5 сек. Промывают водой. Докрашивают метиленовой синью или 1 % водным раствором малахитовой зелени 3–5 мин. Споры, окрашенные фуксином, имеют рубиново-красный цвет, вегетативные тела микробных клеток при докрашивании синькой Леффлера – синий цвет, при применении малахитовой зелени – зеленый цвет.

Определение подвижности Определение подвижности бактерий проводят при посеве уколом в столбик полужидкого агара. Подвижные микробы растут в толще среды по ходу укола.

Изучение биохимических свойств микроорганизмов

Ферментация источников углеводов. Сахаролитическую способность бактерий проверяют на средах, содержащих 1% углеводов по изменению рН. Углеводы добавляют к среде Гисса. Во избежание внесения в среду с инокулятом небольших количеств сахаров в качестве посевного материала используют одну петлю густой суспензии бактерий. Посевы инкубируют 36–96 ч при 30 – 37 ° С температуре. Для испытания на присутствие кислоты индикатор добавляют в среду после инкубирования. В качестве индикатора используют индикатор бромтимоловый синий (0,04 %).

Определение фермента каталаз. На поверхность микробной культуры, выращенной на плотной питательной среде в чашке Петри, наносят 1–2 см³ 3 % раствора перекиси водорода так, чтобы она покрывала поверхность культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в слое нанесенной жидкости свидетельствует об образовании кислорода в результате расщепления перекиси водорода под действием каталазы.

Определение наличия оксидаз. Выросшие колонии с дифференциально-диагностических сред петлей переносят на кружок фильтровальной бумаги, обильно смоченной реактивом для определения оксидазной активности. Через 2–5 мин. достаточно четко проявляется положительная реакция – сине-фиолетовая окраска ободка или всей колонии.

Нитратредуцирующая способность. Действие бактерий на нитраты обнаруживают по исчезновению нитратов из среды и появлению нитритов, аммиака или свободного азота. Для инокуляции регенерированной и охлажденной мясо-пептонной среды с нитратами используют петлю густой суспензий бактерий. Посевы термостатируют при температуре 30 – 37 ° С и просматривали на наличие роста после 24, 48 и 72 ч. После чего 1 см³ культуральной жидкости переносят в пробирку и добавляют реактив Грисса (через 15–20 мин получалось розовое окрашивание).

Определение цитратного признака. Посев производят уколом в глубину столбика агара Симмонса. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 ^оС 18–20 ч. Цитрат-положительные бактерии изменяют зеленый цвет среды на синий.

Определение продукции индола. Определение продукции индола проводили на агаре Симмонса. На поверхность среды наслаивают 0,1–0,2 см³ реактива-Ковача. В течение первых 5 мин индолположительные микроорганизмы дают малиновое окрашивание кольца.

Определение сероводород. Петлю исследуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясо-пептонным бульоном. После чего в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги на определение сероводорода. Образующийся в культуре сероводород придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.

Реакция с метиловым красным. Посев производят в 1 см³ среды Кларка, а затем инкубируют в течение 24 ч и более при 37 °С. После инкубации прибавляют 0,1–0,2 см³ реактива Кларка. Покраснение среды указывает на прекращение микробного метаболизма в результате резко кислой реакции среды (положительная реакция); желтый цвет свидетельствует о продолжающемся метаболическом процессе и подщелачивания среды за счет расщепления пептона (отрицательная реакция).

Реакция Фогеса-Проскауера (наличие ацетоина) К бактериальной культуре прибавляют 0,2–0,3 см³ реактива Баррита и 0,1 см³ 40 % водного раствора КОН. Появление на поверхности среды кольца окраски разной степени интенсивности – от розового до ярко-красного в течение от 5–10 мин до 2 ч указывает на продукцию ацетоина.

Гидролиз мочевин. Посев микроорганизмов производят уколом в глубину столбика среды с мочевиной Кристенсена для определения уреазной активности. Посев инкубируют в термостате при температуре 37 ^оС от нескольких часов до 4 сут. При положительном результате среда из желтоватой становится красной.

Определение желатиназной активности. Среду для определения желатиназной активности разливают в пробирки столбиком по 5–6 см³. Посев бактерий производят уколом, погружая петлю с исследуемой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Посевы инкубируют при двух температурах (20…22 и 37 °С). Если под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной среды.

Определение декарбоксилаз лизина, аргинина, орнитина. Колонии микроорганизмов вносят в глубину среды для определения декарбоксилаз аминокислот. Посев инкубируют при температуре 37 ^оС от нескольких часов до 1 сут. При расщеплении аминокислот цвет среды становится из желтого синим. Цвет контрольной среды остается желтым.

Определение фенилаланиндезаминазы. Колонии микроорганизмов вносят в глубину среды для определения фенилаланиндезаминазы. Содержимое пробирки перемешивают. Посев инкубируют в термостате при температуре 37 ^оС от нескольких часов до 1 сут. В случае образования фенилпирувиновой кислоты поверхность агара приобретает зеленый цвет.

Липазная активность. Для определения липазной активности (титрометрическим методом) в сухую колбу вноят 1,3 см³ оливкового масла, добавляют 1 см³ физиологического раствора и интенсивно перемешивают. В ту же колбу добавляют 3 см³ культуральной жидкости или клеток микробов, суспендированных в 1,5 см³ дистиллированной воды. Содержимое колбы встряхивают 2–3 мин и помещают в термостат на 18 ч в условиях покоя. По окончании добавляют 15 см³ этанола (для предотвращения гидролитической диссоциации мыла) и 12,5 см³ серного эфира (для разрушения эмульсии). Полученную смесь титруют 0,1 н. NaOH с тимолфталеином. Липазную активность определяют по количеству (в см³) 0,1 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование образовавшихся жирных кислот; 1 см³ щелочи соответствует 500 условным единицам липазной активности.

Видовой состав бактерий, их численность позволяет судить об интенсивности, как процессов загрязнения, так и процессов самоочищения. Таксономический состав выделенных из проб воды бактерий может показать характер вносимых в водоем загрязнений, поскольку аллохтонные бактерии развиваются при появлении доступного субстрата. Метод позволяет зарегистрировать многих представителей бактероценоза, что в свою очередь позволить судить о его структуре и направленности пищевых процессов в водоеме. Метод не требует дорогостоящего оборудования, достаточно достоверный при выделении наиболее хорошо изученных и часто встречающихся в водных экосистемах родов бактерий. Однако, весьма трудоемкий и громоздкий.