7.Особенности фазово-контрастной и темнопольной микроскопии

Микроскопия в темном поле зрения основана на следующем принципе (рис. 1.14). Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя: поле зрения остается темным, а объект на его фоне оказывается светящимся. Это достигается с помощью специального конденсора (параболоид) или обычного конденсора, прикрытого в центре кружком черной бумаги.

Рис. 1.14. Схема микроскопа для наблюдения в темном поле.

Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу «висячей» и «раздавленной» капли. При приготовлении препарата «раздавленная» капля исследуемый материал (бактериальную культуру в физиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покрывают покровным стеклом. Капля материала заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Для приготовления «висячей» капли необходимо использовать специальные предметные стекла с углублением в центре и покровные стекла. На середину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углубления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают покровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления. Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.

Фазово-контрастная микроскопия При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным, необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. Это достигается с помощью фазово-контрастного конденсора и фазового объектива (рис. 1.15). Рис. 1.15.

Схема фазово-контрастного микроскопа.

Фазово-контрастный конденсор представляет собой обычный объектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую получают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива. Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.  8. Основные характеристики электронного микроскопа (разрешающая способность, общее увеличение). Особенности люминесцентной микроскопии.

Электронная микроскопия Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (рис. 1.17).

Рис. 1.17. Схема трансмиссионного электронного микроскопа. В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электронов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут соответственно задерживаться, что проявится на экране участками затемнения. Объект приобретает контрастность. Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др. С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.  9. Этапы приготовления мазка для иммерсионной микроскопии.

Для приготовления мазка необходимо иметь:

• Чистое обезжиренное предметное стекло.

• Бактериологическую петлю

• Культуру, выращенную на плотной питательной среде — агаре, или жидкой среде — бульоне.

• Спиртовку.

• Набор красок.

1. Обезжиренное предметное стекло и бактериологическую петлю прожигают в пламени горелки. Пробирку с изучаемой культурой держат между указательным и большим пальцами левой руки. Петлю берут правой рукой, мизинцем правой руки прижимают пробку пробирки к ладони.

Если мазок готовится с жидкой питательной среды, то каплю культуры на­носят петлей на предметное стекло.

Если мазок делают из культуры с агара, то петлю с культурой вносят на предметное стекло и добавляют каплю физиологического раствора, в котором эмульгируют внесенный материал.

Петлю обжигают в пламени горелки. Мазок должен быть тонким, рав­номерно растертым, округлой формы, размером 1,5-2 см.

2. Высушивание мазка производится при комнатной температуре.

3. Фиксация мазка производится с целью:

• Убить микробные клетки.

• Обеспечить лучшее прилипание микробов к предметному стеклу.

• Облегчить дальнейшее окрашивание.

Фиксация мазка в пламени горелки производится 3-кратно, действие пла­мени должно длиться 2 секунды.

Для более нежной фиксации мазков крови, спирохет и простейших использующих химические фиксаторы:

• Метиловый спирт в течении 5-и минут.

• Этиловый спирт (96°) в течении 10-и минут.

• Смесь Никифорова — в течении 10-15 минут.

• Ацетон — в течении 5-и минут.

• Пары формалина — в течении нескольких секунд.

4. Окраска препаратов проводится:

• Простыми методами (водным фуксином Пфейффера, метиленовой синькой Леффлера), когда окрашивается вся клетка и используется только один краситель;

• Сложными методам, когда определяются клеточные структуры,

После экспозиции мазок промывают водой, высушивают фильтроваль­ной бумагой и микроскопируют под иммерсией.