Предмет и задачи гистологии и цитологии

Гистология человека – фундаментальная медико-биологическая наука, изучающая микроскопическое строение и жизнедеятельность тканей, образующих его тело. В более широком смысле, предмет ее изучения охватывает также микроскопическое строение и жизнедеятельность органов человека. Гистология как наука и как учебная дисциплина традиционно объединяет два раздела: общую гистологию и частную гистологию.

Общая гистология изучает основные, фундаментальные свойства важнейших групп тканей.

Частная гистология человека изучает особенности структурно-функциональной организации и взаимодействия тканей в составе конкретных органов

Курс гистологии в медицинском ВУЗе включает в себя учение о клетке – цитологию, а также учение о пренатальном развитии организма – эмбриологию.

Цитология – наука о закономерностях строения, развития и жизнедеятельности клетки. Современные гистология и цитология представляют собой не сугубо морфологические, а морфофункциональные научные дисциплины.

Гистология и цитология в настоящее время являются важной частью медицинского образования. Они создают основу для изучения других фундаментальных медико-биологических дисциплин (физиологии, биохимии, патологической физиологии, иммунологии, фармакологии).

Вместе с тем, понимание причин, механизмов и следствий заболеваний все в большей степени основывается на знании гистологии, ультраструктуры и биологии клетки. Поэтому правильные представления о структурно-функциональной организации клеток и тканей человека, а также об их участии в важнейших механизмах биологических процессов создает основу для понимания патогенеза и морфогенеза заболеваний человека. Современная гистология и цитология обеспечивают необходимый базис для успешного освоения клинических предметов и выполняет роль интегративных наук, осуществляющих связь между медико-биологическими и клиническими дисциплинами и способствующих формированию врачебного мышления.

Данные гистологических и цитологических исследований все более широко используются в клинической диагностике различных заболеваний. Оценка характера изменений строения клеток, тканей и органов при патологических процессах, осуществляемая в ходе диагностических гисто- и цитопатологических исследований, требует глубокого знания их нормального строения. Внедрение в медицинскую практику новых морфофункциональных методов, основанных на достижениях современной иммунологии и молекулярной биологии, еще в большей степени повышает эффективность и диагностическую ценность цито-гистологических методов.

Настоящее методическое пособие составлено для студентов педиатрического факультета Башгосмедуниверситета.

На практических занятиях студент изучает структурную организацию клеточных элементов, тканей и органов на данном препарате, при этом студенты производят зарисовку препарата и обозначение на рисунке всех основных элементов.

Во время работы с микропрепаратами преподаватель оказывает индивидуальную помощь студентам в усвоении учебных элементов препарата.

В конце практического занятия преподаватель проверяет правильность проделанной работы студентов на альбомах.

Основы гистологической техники.

Для приготовления гистологических препаратов взятые кусочки тканей и органов должны пройти следующие этапы проводки: 1 - взятие материала, 2 - фиксация, 3 - промывание, 4 - обезвоживание материала, 5 - уплотнение, 6 - изготовление срезов, 7 - окрашивание срезов, 8 - обезвоживание, 9 - просветление, 10 - заключение.

1. Взятие материала. Для приготовления гистологических препаратов материал берут от животных, умерщвленных для этой цели, от животных и людей во время операции (биопсия) и от трупов.

2. Фиксация проводится для сохранения прижизненной структуры ткани и кусочков органов путем быстрой коагуляции ее белков. Различают простые фиксаторы (чаще всего 10% формалин) и сложные (смесь Ценкера, Буэна, Мюллера и др.). Вырезанный кусочек или орган следует тотчас же опускать в заранее приготовленную фиксирующую жидкость. Количество фиксирующей жидкости должно в 20-30 раз превосходить объем кусочка. Срок фиксации тканей в формалине 24-48 часов. В большинстве случаев фиксация производится при комнатной температуре. Размер исследуемых кусочков должен быть не более 1×1 см. Фиксирующие растворы следует готовить непосредственно перед их употреблением.

3. Промывание. По окончании фиксации объекты промывают водой для удаления фиксатора и артефактов. Промывка длится до 1-2 суток.

4. Обезвоживание материала. При этом взятые кусочки тканей последовательно обрабатывают спиртом возрастающей концентрации (70 %, 80 %, 96%, 100%) в каждом растворе по 24 часа. Вслед за обезвоживанием в спиртах следует заливка материала в специальные плотные среды (парафин).

5. Уплотнение. Схема заливки в парафин:

1. Обезвоживание в спиртах 70 %, 80 %, 96 % и абсолютный спирт по 24 часа в каждом.

2. Погружение объекта в смесь равных частей абсолютного спирта и ксилола на 1-3 часа.

3. Перенос объекта в чистый ксилол на 3 часа.

4. Погружение в раствор парафина в ксилоле при температуре 37 градусов на 2 часа.

5. Перенос в 1-й чистый парафин на 2 часа при температуре термостата 56 градусов.

6. Перенос во 2-й чистый парафин на 1-2 часа при 56 градусов.

7. Заливка материала чистым парафином в бумажных формочках.

8. Наклеивание на деревянные кубики.

6. Изготовление срезов производится на санном микротоме толщиной 7-10 мкм. Предварительно предметные стекла очищают от грязи и обезжиривают их поверхность. Для того чтобы парафиновые срезы можно было подвергнуть дальнейшей обработке, их необходимо наклеить на предметное стекло в расправленном положении. Клеевой основой для предметных стекол служит белок куриного яйца с глицерином в равных количествах по объему. Предварительно срезы переносят в теплую воду для расправления, затем смазанное белком с глицерином предметное стекло подводят в наклонном положении под плавающий срез.

7. Окраска препаратов. Различная кислотность субстрата клетки обеспечивает избирательное отношение частей клетки к красителям. Структуры, имеющие кислую реакцию, обладают сродством к основным красителям, поэтому их называют базофильными (базофильны ядра клеток, цитоплазма белоксинтезирующих клеток). Свойство окрашиваться основными красителями – базофилия. Структуры, щелочной реакцией обладают сродством к кислым красителям (оксифилия) и называются оксифильными (цитоплазма большинства клеток, волокна межклеточного вещества). Окраска гематоксилин - эозином наиболее распространенный метод окрашивания срезов. Гематоксилин окрашивает ядро в синий цвет, тогда как эозин окрашивает цитоплазму в красный цвет. Гематоксилин представляет собой экстракт древесины кампешевого дерева. Эозин – искусственная краска.

Схема окраски гематоксилин – эозином парафиновых срезов.

- Срезы, подлежащие окраске, нужно освободить от пропитывающего их парафина в 2-х порциях ксилола – 4-5 мин.

- Удалить из срезов ксилол в 100 градусном спирте – 2-3 мин.

- Выдержать срезы в 96 % спирте – 2-3 мин.

- Выдержать срезы в 70 % спирте – 2-3 мин.

- В воде дистиллированной – 1-2 мин.

- Окраска гематоксилином – 3-5 мин.

- Сполоснуть в водопроводной воде.

- Окрасить эозином – 1 мин.

- Промыть в воде.

8. Обезвоживание окрашенных срезов в спиртах возрастающей крепости по 1-2 мин.

9. Просветление в ксилоле 1-2 мин.

10. Заключение. Осуществляется путем нанесения бальзама на срез и осторожным покрытием препарата покровным стеклом. После высушивания гистологический препарат готов для изучения.

Количественная оценка клеточных и тканевых структур.

Морфометрические методы представляют собой совокупность приемов, позволяющих дать количественную оценку параметров клеточных и тканевых структур на гистологических и цитологических препаратах (или их фотографиях). Путем использования этих методов определяют такие параметры, как, например, диаметр, высоту, толщину, площадь сечения, количество объектов на единице площади, их форму и др. При морфометрии объектов на гистологических препаратах необходимо учитывать, что оцениваемые параметры относятся не к собственно тканевым компонентам, а к сечениям на срезах. Морфометрические методы могут использоваться при изучении объектов не только под световым микроскопом, но и на электронно-микроскопическом уровне.

Стереологические методы, в отличие от стандартных морфометрических, позволяют путем специальных приемов и расчетов определить истинные (трехмерные) параметры объектов (например, их относительный объем, содержание в единице объема и др.), исходя из оценки на срезах их линейных и плоскостных параметров.

Ручная морфометрия основана на проведении подсчетов визуально, непосредственно под микроскопом или на микрофотографиях с использованием линеек, сеток (в том числе в виде окулярных вставок) и других приспособлений.

Методы полуавтоматического и автоматического анализа изображения с применением компъютеров получили широкое распространение благодаря своей высокой производительности. Они позволяют быстро количественно оценить большое число признаков на изучаемом препарате и по их совокупности идентифицировать различные структуры (например, типы клеток по распределению хроматина в их ядрах).

Приборные микроскопические методы для количественной оценки гистохимических и иммуногистохимических реакций.

Цитофотометрия – количественный приборный метод, дающий возможность оценить содержание исследуемого вещества в структурных элементах тканей и клеток. Измерения производятся на специальном приборе – цитофотометре – путем оценки оптической плотности окрашенного изучаемого вещества гистохимической реакцией в пределах определенной площади препарата (зонда) при длине световой волны, соответствующей максимуму поглощения использованного красителя. При измерении содержания ДНК полученные данные сопоставляют с результатами измерений в заведомо диплоидных клетках (например, в покоящихся лимфоцитах), что позволяет оценивать результаты в единицах плоидности.

Проточная цитометрия, или флоу-цитометрия (от англ. flow – поток) – высокоэффективный приборный количественный метод оценки содержания веществ в клетках, находящихся в суспензиях.

Подготовка клеток к анализу заключается в их окрашивании с использованием флюоресцирующих красителей в цитохимических или иммуноцитохимических реакциях. В последнем случае красители конъюгированы со специфическими антителами. При работе с тканями их предварительно обрабатывают ферментами для разрушения межклеточных связей и получения клеточных суспензий.

Окраска клеток флюоресцирующими красителями используется для маркировки искомого вещества. Некоторые вещества можно непосредственно выявить путем цитохимической реакции с избирательно связывающимся с ними красителем (например, ДНК с помощью бромида этидия). Для маркировки вещества клетки обрабатывают специфическими антителами, с которыми конъюгированы флюоресцирующие красители. При этом маркированные антитела связываются с соответствующими клеточными антителами (веществами) в результате иммуноцитохимической реакции.

Проточный цитометр (флоу-цитометр) с высокой скоростью пропускает суспензию окрашенных клеток через узкую капиллярную трубку, освещенную лучом лазера. Уровень флюоресценции каждой клетки или ее ядра (соответствующий содержанию исследуемого вещества) последовательно регистрируется с помощью специальных детекторов со скоростью до нескольких десятков тысяч клеток в 1 мин. С построением соответствующих гистограмм (графиков распределения) содержания веществ. В некоторых случаях через капилляр пропускают неокрашенные клетки (форменные элементы крови) и оценивают распределение их размеров и формы.

Клеточная сортировка позволяет выделить клетки с определенными маркерными признаками (или их сочетанием) из клеточной суспензии. Процедура реализуется с использованием специального прибора – сортера (клеточного анализатора), работающего по принципу проточного цитометра, но с возможностью формирования мелких капель, содержащих определенные клетки, которые, в зависимости от наличия маркировочного сигнала, сортируются и направляются в различные контейнеры.

Специальные типы микроскопии.

Темнопольная. Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещенный на темном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзе микроскопа поступают только рассеянные лучи.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии.

Поляризационная микроскопия – формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы).

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов.

Люминесцентная микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов.

Электронная микроскопия. С помощью электронного микроскопа можно изучить тончайшее строение ультрамикроструктур тканей и клеток. Главным отличием электронного микроскопа от светового микроскопа является то, что в нем вместо света применяется поток электронов, а обычные стеклянные линзы заменены электромагнитными полями. Для исследования в электронном микроскопе применяют ультратонкие срезы с помощью ультрамикротома. Обработка кусочков органов и тканей размерами 1×1 мм для электронной микроскопии принципиально сходна. Особенностью является то, что фиксация производится осмиевой кислотой, солями марганца при определенной Рн среды, а заливка осуществляется в органические смолы.

Гистохимический метод. В основе гистохимического метода лежит применение химических реакций для выявления распределения химического вещества в структурах клеток, тканей и органов. Современные гистохимические методы позволяют выявлять в структурах аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, активность ферментов.

Метод авторадиографии позволяет наиболее полно изучить обмен веществ в структурах клетки. В основе метода лежит использование радиоактивных элементов или меченых ими соединений. В организм животных вводят один из радиоактивных элементов и через определенные промежутки времени определяют его содержание в тканях и органах. Выявление радиоактивных элементов в гистологических срезах производят с помощью фотоэмульсии, которую прикладывают к препарату и затем проявляют. В участках препарата, где содержится радиоактивный элемент, имеет место радиоактивное излучение. Под влиянием этого излучения происходит восстановление бесцветного бромистого серебра в черное металлическое серебро. В фотоэмульсии на соответствующих участках наблюдается появление хорошо видимых черных зерен серебра. С помощью этого метода можно определить скорость включения аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, обмен йода в клетках щитовидной железы и т.д.

Культура тканей. Изучение культуры тканей может производиться как вне организма, так и в составе организма. Метод культуры тканей вне организма заключается в том, что клетки и ткани выращиваются вне организма, при этом клетки способны к движению, размножению, дифференцировке.

Правила работы с микроскопом:

1. Установить микроскоп у края стола перед собой.

2. Установить (до защелкивания) объектив малого увеличения и осветить поле зрения вогнутой стороной зеркала.

3. Поместить препарат на предметный столик обязательно вверх покровным стеклом и установить фокус вращением макроскопического винта.

4. Передвигая препарат рукой, рассмотреть его при малом увеличении. Винты столика при этом не используются.

5. Установить нужное место препарата в центре поля зрения и лишь после этого перевести микроскоп на большое увеличение. Найти изображение объекта осторожным вращением (не более 1 оборота!) макрометрического винта. Вращение микрометрического винта необходимо для рассмотрения препарата на всю его глубину. Винты столика служат только для перемещения препарата в пределах одного поля зрения. Для улучшения освещенности и контрастности препарата допускается перемещение конденсора (винт справа ниже столика).

6. Закончив работу, перевести микроскоп на малое увеличение. Наибольшее увеличение дают иммерсионные объективы – 90 х и 100 х. Их фронтальные линзы погружают в среду (иммерсионное масло), которая препятствует рассеиванию лучей, что улучшает качество изображения. При работе с иммерсионным объективом допустим лишь незначительный поворот микрометрического винта, так как расстояние между покровным стеклом и фронтальной линзой объектива очень мало.

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений объектива и окуляра.

Контрольные вопросы:

1. Этапы приготовления гистологического препарата.

2. Цель и принципы фиксации.

3. Цель и способы заливки. Изготовление срезов.

4. Методы и принципы окрашивания препаратов. Основные и кислые красители.

5. Понятие об оксифилии и базофилии.

6. Методы микроскопирования.

7. Методы, дающие количественную и функциональную оценку структур препарата.

8. Правила работы с микроскопом.

Практическое занятие.

Тема: «Органоиды общего, специального назначения и включения».

1. Актуальность темы. Клетка как структурная единица организма несет значительную функциональную нагрузку. Рост организма, его строение, функционирование и смерть есть выражение кооперативной работы клеток нашего организма. Выявление структурных проявлений в функциональной активности клеток.

2. Цель занятия. Изучить микро- и ультрамикроскопическое строение и функциональное значение органелл общего назначения, специального назначения и включения.

Для достижения конечной цели студент должен знать:

а) основные положения современного учения о клетке как элементарной живой системе, основы формообразования всего органического мира;

б) строение основных структурных компонентов клетки (ядро, цитоплазма, цитолемма) и мелких структурных компонентов (органелл и включений).

Должен иметь:

а) понятие о секреторном цикле клетки; б) понятие о жизненном цикле клетки (рост, дифференцировка, старение и смерть клетки); в) понятие о регенерации, митотическом цикле и его фазах; г) понятие о методах исследования живых и фиксированных клеток.

3. Ориентировочное время для самоподготовки – 135 мин.

4. Место проведения самоподготовки читальный зал библиотеки, кабинет самоподготовки кафедры.

5. Оснащение: микроскопы, микропрепараты, таблицы, электронные микрофотографии, методические пособия, атласы.

Контрольные вопросы:

1. Расскажите историю создания и основные положения клеточной теории.

2. Дайте определение клетки, какой формы могут быть клетки.

3. Каковы строение, химический состав и физико-химические свойства биологической мембраны и плазмолеммы?

4. Какие способы транспорта веществ через плазмолемму вам известны? Что такое фагоцитоз и пиноцитоз?

5. Перечислите неклеточные структуры. Расскажите об их строении. Приведите примеры.

6. Структуры поверхности клеток. Микроворсинки или щеточная каемка как органоиды, участвующие в процессе всасывания питательных веществ клетками. Строение и значение контактов между клетками.

7. Химический состав, основные физико-химические и биологические свойства цитоплазмы.

8. Строение интерфазного ядра. Значение ядра в жизнедеятельности клетки.

9. Классификация, строение и функциональная характеристика органелл общего и специального назначения.

10. Дайте определение включений.

11. Включения клетки: классификация, гистохимическая и морфологическая характеристика.

12. Функциональные особенности включений.

Учебные микропрепараты.

1. Комплекс Гольджи – нервные клетки спинномозгового узла. Импрегнация солянокислым серебром.

При большом увеличении найти крупные округлой формы нервные клетки (сконцентрированные по периферии среза) с центрально расположенным ядром. Комплекс Гольджи выявляется в виде сети или зерен, расположенные в цитоплазме, концентрируясь вокруг ядра.

Зарисовать 3-5 клеток и обозначить: ядро, клеточная оболочка, комплекс Гольджи в цитоплазме.

2. Митохондрии в эпителии кишки. Окраска по Альтману.

При малом увеличении найти срез эпителиального слоя кишки.

При большом увеличении микроскопа рассмотреть высокие призматической формы эпителиальные клетки. В базальной части этих клеток располагаются овальной формы ядра со слабой окрашиваемостью. Границы клеток также трудно различимы. В цитоплазме выявляются скопления митохондрий в виде зерен и палочек, разбросанных по всей цитоплазме и с некоторой концентрацией в апикальной части клетки.

Зарисовать 3-5 клеток и обозначить на рисунке: ядро эпителиальной клетки, оболочка клетки, цитоплазма клетки, митохондрии.

3. Жировые включения в клетках печени. Окраска осмиевая кислота + сафранин.

При малом увеличении микроскопа найти срез органа, импрегнированный осмием. Установить срез в центре поля зрения.

При большом увеличении рассмотреть клетки полигональной формы с розовыми ядрами и четкими темными границами. В цитоплазме хорошо видны жировые включения в виде черных капель различной величины.

Зарисовать 3-5 клеток и обозначить: цитоплазма, ядро и жировые включения.

4. Включения гликогена в клетках печени. Окраска ШИК-реакция.

При большом увеличении микроскопа рассмотреть в цитоплазме клеток печени гранулы гликогена, окрашенные в малиновый цвет.

Зарисовать и обозначить: цитоплазма, ядро, гранулы гликогена.