3. Ретровіруси. Вірус імунодефіциту людини. Снід-асоційовані інфекції.

ВІРУСИ ІМУНОДЕФІЦИТУ ЛЮДИНИ

У середині 1981 р. Центр по контролю захворюванності США одержав повідомлення, що за останні 8 місяців в районі Лос-Анжелеса було діагностовано 5 випадків пневмоцистоза - дуже рідкісного типу пневмонії, яка викликається Pneumocystis carinii.

Pneumocystis carinii.

Вона зустрічалась в молодих мужчин-гомосексуалістів. Однак цей збудник належав до умовнопатогенних мікроорганізмів, які безпечні для здорової людини. Але у людей, чия імунна система з тієї чи іншоі причини ослаблена, вони викликали хворобу. Вона настільки зустрічалась рідко, так що ліки для неї вважались експериментальними і призначались тільки з дозволу Центру по контролю захворюваності США (ЦКЗ). У той же час за період з 1967 по 1979 рік цей препарат призначався тільки двічі.

    Приблизно в цей час ЦКЗ одержав повідомлення про збільшення захворюваності одним видом раку - саркомою Капоші.

Саркома Капоші

До цього це захворювання рідко зустрічалось в США - і головним чином серед мужчин похилого віку, які приймали препарати, що пригнічують дію імунної системи. Однак зараз протягом 30 місяців було зареєстровано 26 випадків саркоми і знову таки у молодих мужчин гомосексуалістів в Нью-Йорку. У деяких з них також була пневмонія (P. carinii) та інші важкі опортуністичні хвороби.

    Пізніше клініцисти та епідеміологи помітили збільшення числа випадків у мужчин-гомосексуалістів двух явищ, які не можна було пояснити: хронічної лімфаденопатії (стан, який характерізується збільшенням лімфатичних вузлів) і досить рідкої так званої недиференційованої неходжкінської лімфоми. І також в основі цих зрушень лежали тяжкі ураження імунної системи.

    Цей клінічний комплекс було класифіковано як абсолютно новий синдром, який в 1982 році одержав назву СНІДу – синдрому набутого імунодефіциту (AIDS). Було встановлено, що у хворих виснажується популяція певних лімфоцитів, зокремаT4 клітини.

     У 1980 р. колектив, який очолював Р. Галло вперше виділив ретровірус людини - Т лімфотронний вірус типу І людини (HTLV - 1 - human T-lymphatropk virus type I). Цей вірус уражає Т-лімфоціти і викликає досить агрессивний рак (Т- клітинний лейкоз), який ендемічний для Японії, Африки, країн Карибського басейну та інших регіонів. Тільки в Японії нараховується понад 1,5 млн носіїв цього вірусу. Він може передаватись  від матері до дитини, а також  при переливання крові, статевихї контактах. Захворювання проявляється неврологічною симптоматикою, хронічною мієлопатією, дисфункцією сфінктерів.  Захворювання подібно до розсіяного склерозу та бокового аміотрофічного склерозу.

Двома роками пізніше ця ж  група виділила HTLV-II, який також виникликає деякі форми лейкозів (волосистоклітинний), але більш хронічного типу ніж HTLV-I.

Цим двом вірусам придатні одні й тіж особливості - обоє розповсюджуються з кров`ю, статевим контактом і від матері дитини. І там і там хвороба розвивається після тривалого латентного періоду (2 роки), уражаються Т-лімфоцити.

Галло вважав, що це ретровірус. На підтвердження цієї гіпотези було доказано, що ретровірус FeLV (feline leukemia virus – вірус лейкозу котів) виникає рак або пригнічує імунну систему.

Було зроблено гіпотезу, що збудник СНІД - це вірус HTLV -I. Вона не підтвердилась, але стимулювала широкий науковий пошук.

    Люк Монтан`є  у Франції з створив робочу групу з вивченю СНІД ( з першими повідомленнями). Французськи дослідники вирішили перевірити гіпотезу групи Галло.

У 1983 р. після культивування збільшеного лімфовузла молодого гомосексуаліста через 15 днів в культуральній рідині було знайдено фермент - транскриптазу. Значить там був вірус. Він мав особливі властивості - викликав симтомоутворення клітин, але по морфологіїі і серологічним ознакам відрізнявся від HTLV-I i HTLV-II. У великих кількостях накопичувався в культурах клітин В лімфоцитів, попередньо трансформованих вірусом Енштейн-Бар (герпес вірус), були серологічні перехрести з поверхневими білками HTLV I.

Його позначали як LAV (lymphadenopathy associated virus), він розмножувався в Т4, але не в Т 8  клітинах . Вдалось ідентифікувати вірусний білок р25 (або р24), якщо не було в HTLV-I

Cпочатку антитіла до LAV знаходились у переважній більшості людей з лімфаденопатією, і дуже мало при СНІДі. Але при розширенні обстеження хворих СНІД доля позитивних осіб збільшувалась і досягла 40%.

Монтаньє був впевнений, що це є збудник. Галло був не такий однозначний. Він направив зусилля на одержання великої кількості віруса з крові хворих на СНІД. І вдалося доказати, що в уіх 48 обстежених препаратів від осіб з групи ризику одержали один і той же вірус, який назвали HTLV -III.

В жодної людини, яка веде звичайне статеве життя цього вірусу не було.

Через деякий час була встановлена тотожність вірусу HTLV-III i LAV. І з 1986 р. (ІІІ конгрес по СНІДу в Парижі) йому надане ім`я HIV (human immunodificiency virus). Було показано, що HIV здатен заражати не тільки Т4, але й макрофаги. А вони здатні проходити через ГЕБ, заносити вірус в мозок. Цим і пояснюється патологія нервової системи, яка спостерігається у хворих на СНІД.

Після такого різкого накопичення даних темпи знизились. Але й надалі не обійшлось без сюрпризів. В жовтні 1985 року  Монтан`є аналізував зразки крові, доставлені португальскими дослідниками з Гвінеї-Бісау (Зах. Америка). У деяких осіб клінічно було діагностовано СНІД, хоча HIV в крові не знаходили.

Один з зразків давав постійну негативну реакцію на HIV при застосуванні самих витончених методів  аналізами. Однак врешті з крові вдалось виділити якійсь вірус. Аналізуючи його на нуклеотидні послідовності ДНК  прийшли до висновку, що вони мало комплементарні. Значить, це було виділено новий вірус, його позначили HIV-2.

В еволюційному плані він має родинні зв`язки з HIV-I. В них однакова структура і обидва викликають СНІД. HIV -2 - в основному в Зах. Африці, HIV -I - Центр Африки та інші країни світу.

Виділення HIV -2 - поставило питання про еволюції вірусів.

 

Морфологія збудника

Збудники СНІДу належать до родини Retroviridae, підродини Lentiviridae, куди фходять віруси вісни, меді (вісна - демієлінізуюча хронічна інфекція у вівців,  меді - прогресуюча пневмонія у вівців).

 

ВІЛ

 

Збудник СНІД - складний за  будовою вірус. У центрі віріона – серцевина, яка містить електронно-щільний нуклеоїд з вірусним геномом. Це дві однакових нитки РНК, ассоційованих з оберненою трансриптазою. Оточений цей комплекс білковою оболонкою, а зверху двошаровою ліпідною мембраною, яку вірус набуває при проходженні клітинної мембрани. З нею асоційований глікопентид gр 41, з яким з`єднаний поверхневий gр120, який входить до складу відростків віріалу. Віріони мають сферічну форму, діаметр - 100-120 нм. Серцевина віріону має  конусовидну (грушеподібну будову), вона не повністю заповнює об`єм вірусу, розміщена ексцентрічно. 

Будова ВІЛ

Від поверхні зовнішньої мембрани відходять відростки діаметром 15 нм і висотою 9 нм. Вони можуть бути загублені вірусом при вивільнені з клітини, що можливо зв`язано з втратою інфекційності.

При старанному електронно-мікроскопічному дослідженні ВІЛ знайдені ще два “латеріальних тіла”, невідомоъ природи, які знаходяться під зовнішньою оболонкою, на ділянках які не заняті нуклеоїдом.

Таким чином, відмінні ознаки віруса: поверхневі відросткові структури та ексцентрично розміщена витягнута компактна серцевина.

Вірус високочутливий до нагрівання (при  56 °С протягом 30 хв його активність зменшується в 100 раз) і до широкозастосовуваних дезинфекантів навіть в концентрациях меньших ніж  звичайно. Вірус інактивується ефіром, ацетоном, етанолом (20 %), гіпохлоритом натрію (0,2 %), бета-протонілантоном  0,25 % (1:400), перекисом водню 0,3 %, глютаральдегідом (0,0125 %) . Однак він відносно резистентний до УФО,  іонізуючої радіації. Ці дані можуть бути використані при проведенні дезинфекції і при інактивації віруса.

Гемаглютинуючої активності не має. Довше зберігає свої патогенні властивості при кімнатній температурі, ніж решта ретровірусів..

 

Молекулярна біологія ВІЧ.

Геном являє собою двониткову РНК з коефіцентом седиментації 35 S. Геном містить 9213 нуклеотидів і має 9 генів Це особливі послідовності нуклеотидів, що включають транскрипцію вірусних генів. При цьому ферменти, які належать клітині-господарю синтезують РНК-копії провіруса. Частина їх стане генетичним матеріалом нових варіантів, а частина використовується як м РНК для синтезу структури білків і ферментів, що ввійдуть до складу віріона. Вірус або брункується (клітина лишається неушкодженою), а якщо інтенсивна реплікація - лізіс клітини, вона гине.

Основні гени: gag -кодує білки серцевини,  pol - ферменти, env - білки оболонки. Ці гени є у всіх вірусів раку  і лейкозу. Крім того, у віруса є ряд генів-регуляторів: tat -позитивний регулятор,  rev (art, trs) - вибірковий регулятор, vif (sor, A, P, Q) - фактор інфекційності, vpr, vpn- функція їх невідома, nef (3’orf, B, E, F) - негативний регулятор.

 

Ген gag складається з 1500 пар нуклеотидів, кодує білки р17, р24-25, р15, які нарізаються внаслідок процесингу з білка-попередника молекулярною масою р54.  Однак молекулярна маса цих всіх білків ще уточнюється.

    Цей ген короткий, ніж у решти ретровірусів, які кодують не 3 а 4 білка. Ці внутрішні білки найбільш консерівативні і мають спільні антигенні детермінанти з внутрішніми білками інших ретровірусів - лептівірусів і групи HTLV.

Ген pol (головним чином, ревертаза) займає ключове положення у ВІЛ. Він складається з  3300 пар нуклеотидів, відрізняється за своєю гомологією на 80-90 % від решти вірусів. Він кодує три ферменти: ревертазу. вірусспецифічну протеазу і ендонуклеазу. Ендонуклеаза (інтеграза) - це білок р34. Антитіла проти неї знаходять у 92,6 %  хворих на СНІД. Вона нарізає кільцеву ДНК ВІЛ перед інтеграцією її в геном клітини  за місцем зєднання двох  Ltr.

Ген env  складається з  2600 пар основ. Він кодує білки gp41 (знаходиться у ліпідній оболонці)  і gp 120 (розміщається на оболонці вірусів).

Висока молекулярна маса зв`язана з високимступенем глікозилірування. Можливо, з цією обставиною зв`язана висока антигенна варіабельність особливо для др120.

Такі відмінності по цому білку знадені навіть в одного і того ж  хворого. Це має принципове значення так як саме цей білок визначає інфекційність ВІЛ і синтез протективних противірусних антитіл. І ці антитіла можуть пригнічувати розмноження ВІЧ в культурах клітин.

В ділянці гену env, який кодує gр41, є нуклеотидна послідовність, яка кодує гексапептид, який близький до гексапептиду в інтерлейкіні-2, принципового модулятора імунологічних реакцій. Він антагоніст дії інтерлейкіну-2, можливо відповідає за імуносупресію і за цитолітичну дію ВІЧ. Пропонують використати його для створення вакцини.

При генетичному аналізі чисельних ізолятів ВІЛ не знайдено жодного з повним співпадінням нуклеотидних послідовностей. Ізоляти від одного й того ж хворого (які взято з певними проміжками часу) також різняться  за нуклеотидними послідовностями. Навіть дискутується питання: чи це результат багаторазового повторного інфікування різними варіантами ВІЛ, чи наслідок мінливості. Більшіст ьсхиляється до станнього.

Така інтенсивна мінливість сприяє вичлизанню вірусів від дії специфічних антиіл і захисних механізмів клітинного імунітету і хронізації процесу.

УВ реплікації вірусів є три етапи, на яких можуть відбуватись мутації.

По-перше, транскриптаза не здатна до корекції помилок. Тому можливі мутації при синтезі 1-го ланцюга ДНК на РНК матриці, а потім комплементарної 2-ої нитки ДНК. По-друге, клітинна РНК-полімераза також не коректрує помилок (вона синтезує  новий генетичний матеріал для вірусів).

Багато мутацій загибельні для вірусів, але й багато несуть незначне функціональне навантаження, тому не впливають на структуру і життєвий цикл віріону.  Тому штами  можуть сильно відрізнятись генетично, але мати ту ж саму патогенність.  Описано також мутації  по регуляторним генам.

Гени-регулятори tat, rev, vif, nef не визначають синтез структурних білків. а виконують регуляторну функцію.

Особливість гену tat i rev є те, що вони представлені в 2-ох ділянках ДНК, розділені геном env. В процесі транскрипції в результаті подвійного сплайсингу проходить обєднання цих ділянок. Це, напевно, грає критичну роль в життєвому циклі вірусів і забезпечує його персистенцію в заражених клітинах.

Ген tat (transactivator of transcription)  кодує білок р14 (86 амінокислот), який в 1000 разів збільшує рівень експресії м-РНК, тобто підсилює рівень синтезу всіх білків. Він впливає й на транскрипцію, зєднуючись з вірусними LTR, активуючи її приблизно в 12 разів.

Під впливом цього гена відбувається експресія активації інтерлейкіна-2. Вважають, що з цим геном повязаний перехід від латентної ВІЛ-інфекції до її маніфестації. Тому шукаючи  препарати, які болкують tat і його білки, ми наближаємось до розвязання проблем терапії та профілактики СНІДу.

Ген rev (regulator of viron-protein expression) - вибірковий регулятор, який регулює транскрипцію. Він запускає експресію генів gag i env, контролює експресію ВІЛ в цілому. Він визначає єрівновагу між різними мРНК при їх синтезі, а   також перехід від скритої інфекції до активного розмноження віруса. Вважають, що під час реплікації спочатку експресується РНК, яка кодується tat, rev, net, а потім продукти rev індукують синтез мРНК - генів pol, env, vif (sor).

Ген nef (negative regulatory factor) кодує білок р26-27, який знаходиться в цитоплазмі уражених клітин, а не в ядрі. В зрілих віріонах він ппотім не визначається. Білок здатний сповільнювати  транскрипцію вірусного генома, гальмує розмноження вірусів і переводить їх в стан спокою. За своїми властивостями він схожий на клітинні протеїнкінази, які стимулюють певні реакції в клітині.

Ген  vif (virion infectivity factor)  кодує білок р23, а він ініціює ЦПД, стимулює брункування вірусу і його здатність заражати інші клітини.

Такми чином, генолм ВІЛ -  складна поліфункціональна структура, в якій всі компоненти взаємоповязані. Зокрема, ген tat підсилює синтез самого себе і білка гена rev.  Rev сповільнює власний синтез і синтез білка гена tat.  Створюється свого роду динамічна рівновага. Це дозволяє вірусу репродукуватись роками, не знищуючи клітини. Тобто,  це адаптивна ознака ретровірусів, для яких господарями є види з довгою тривалістю життя.

 

Взаємодія вірусів з клітиною

Культивуючи вірус на свіжих лейкоцитах периферичної крові Попович М. (Національний інститут здоровя США), Клацман (Париж) помітили, що в культурі клітин знижується число клітин з антигеном CD4.  Було досліджено, що з рецепторами CD4 взаємодіє  gp120 на зовнішній мембрані віруса.

Вони присутні на: 

–  T4 лімфоцитах (хелпери/індуктори);

–  3 – 10 % B лімфоцитів;

–  10-20 % моноцитів і макрофагів; серед них альфеолярні макрофаги, клітини Лангенгарса шкіри; гліальні клітини і макроглія ЦНС.

Фолікулярні дендритні клітини мигдаликів  можуть інфікуватись без участі CD4 рецепторів.

Взаємодія вірусів із CD4 рецепторами

Вірус може проникати в клітину двома шляхами: за допомогою злиття мембран при звільненні gp41 (інтегрує в стінку лімфоциту) або ендоцитозом.

 

Проникнення вірусу в клітину

 

Загибель лімфоцитів може відбуватись  за допомогою різних механізмів.

По-перше,  HIV розриває клітину, виходячи з неї після реплікації.

По-друге, на поверхні заражених клітин знаходиться gp120, а він взаємодіючи з незараженими клітинами, викликає злиття їх мембран і утворення функціонально скомпрометованого синцитію.

По-третє, вірус виклиткає нормальну імунну відповідь,  і цитотоксичні клітини (NK) або Т8-лейкоцити (Т-кілери) знищують заражені клітини, на поверхні яких є вірусні білки.

По-четверте, в крові циркулює вільний gp120, він здатний адсорбуватись на клітинах з рецепторами  CD4, а імунна система знищує  їх.

По-пяте, клітини гинуть внаслідок дії імуноглобулінів, які зєднуються з антгенами на поверхні клітини, приєднують колмплемент і викликакють лізис клітини.

 

Імунна система

Провідна роль у відповіді і регуляції імунологічних функцій належить Т-лімфоцитам. Т-хелпери (CD4) - регуляторні клітини, допомагають розвитку імунної відповіді; іх різновид -Т-індуктори сприяють активації та взаємодії Т-ефекторів (Т-кілерів) та Т-супресорів (СD8); Т-супресори (регуляторні клітини) - на певній стадії подавляють імунну відповідь; Т-кілери здатні до цитотоксичної дії (приймають участь в забезпеченні протипухлинног, противірусного, трансплантаційног імунітету, гіперчутливості сповільненого типу).

Імунна відповідь

Фагоцитуючи антиген, макрофаги переробляють його і представляють  на власній мембрані разом з антигеном головного комплексу гістосумісності. Вони  синтезують ІЛ-1, g-інтерферон, лізоцим, компоненти системи комплементу. ІЛ-1 стимулює Т-клітини, які розпізнали антиген, до диференціювання та поділу. Отже, імунна відповідь - це чітко сбалансована система.

При попаданні в організм вірусів в першу чергу на заражені клітини реагують природні кілери (NK- літини), проявляючи неспецифічну цитотоксичну дію на антиген. Потім його поглинають макрофаги, обробляють і представляють  на своїй поверхні в переробленому вигляді. Його розпізнають Т-лімфоцити разом з антигенами  MHC. Якщо антигени цього  комплексу тотожні на лімфоцитах і макрофагах, Т-клітина реагує на антиген віруса і активується.

Т-хелпери і Т-індуктори розпізнають антигени МНС ІІ класу, а Т-ефектори - МНС І класу. Т-хелпери продукують  ІЛ-ІІ, а він в свою чергу активує Т-клітини, які починають диференціювання та поділ, утворюючи клони цитотоксичних, хелперних і супресорних клітин. ІЛ-ІІ активує  NK-клітини, вони виділяють g-інтерферон, який стимулює макрофаги і сприяє диференціюванню В-лімфоцитів, перетворенню їх в плазматичні клітини з наступною продукцією імуноглобулінів.

  Таким чином, центральна регулююча роль належить Т-хелперам, які несуть на собі рецептори CD4. І СНІД  веде до достатньо сильного пошкодження імунного реагування.

 

 

Епідеміологія СНІДу

Єдиним джерелом інфекції є хвора людина або вірусоносій. Вірус може проникати в організм різними шляхами. До 1995 р. в Україні домінував статевий шлях передачі, з 1995 - парентеральний:

- парентеральний;

- статевий;

- мати - дитина (вертикальний);

Шляхи передачі СНІДу

На велику небезпеку наражаються люди, якім переливали кров, коли етіологія захворювання була ще невідома. Передати збудник можна при введенні антигемофільного імуноглобуліну (фактор VIII) і компоненту тромбопластину, який знаходиться  в плазмі (ІХ фактор). 

Менший ризик розвитку СНІД у реципієнтів, яким переливають кров та її препарати. Однак це зачіпає групи населення, які не входять до контингенту ризику.

Проте в листопаді 1993 р. в Німеччині виявлено 2000 осіб, заражених вірусом імунодефіциту, які одержали його при переливанні донорської крові, яка поставлялась в 60 клінік.

Безпечним є введення препаратів імуноглобулінів, людського сироваткового альбуміну. Відсутний ВІЛ також ввакцині проти гепатиту В, яку одержують з плазми донорів.  Проте небезпечні  препарати клітинних компонентів крові - еритроцитарної маси,  лейкомаси, тромбоцитарної маси, а також  кістковий мозок.

На другому місці за своєю значущістю знаходиться статевий шлях передачі.  Основна маса - пасивні  гомосексуалісти, особи, реципієнти сперми. Попадаючи в пряму кишку, через тріщини на слизовій оболонці вірус проникає в кров.

Проте сьогодні  зростає число людей, які заразились при гетеросексуальних контактах.  Епідеміологічне обстеження населення окремих районів Африки показало, що антитіла до ВІЛ винайдено у 80 % повій, а 81 % серопозитивних чоловіків  мали регулярні статеві контакти з повіями. Середнє число статевих партнерів у серопозитивних осіб складало 32 на рік.

Підтвердженням передачі ВІЛ статевим шляхом є знаходження збудника в спермі, вмісті піхви, цервікальному секреті серопозитивних осіб. Доказана можливість зараження на СНІД при штучному заплідненні, коли вводиться сперма інфікованих донорів. 

Вважають, що шанс інфікування  партнера складає 59 % незалежно від того, хто інфікований вперше. 

Від 1% до 2 % всіх хворих в США - діти, які заразились трансплацентарно, при проходженні родових шляхів. Не виключено й такий фактор передачі як материнське молоко.

Медичні працівники складають особливу групу щодо можливості зараження на СНІД. Описано поодинокі випадки зараження після укола голкою зі свіжою кровю медичної сестри. У тих, хто доглядає за хворими на СНІД, внутрішньогоспітального СНІДу немає. Вважається, що ризик  інфікування при проникаючих пораненнях складає 0,5 %, в той час як для гепатиту В - 20-30 %.

Летальність досягає 90 %.  Підраховано, що серед осіб поза шлюбом віком 25-43 роки від СНІДу вмирають частіше, ніж від злоякіних новоутворень.

Збудник знайдено в плазмі крові, спиномозковій рідині, грудному молоці, слині, спермі, поті, сльозах, інших секретах. Проте дані щодо концентрації його в біологічних рідинах остаточно не вияснено. Sale довів, що в 1 мл крові може містись від 10 000  до 100 000 віріонів, що в 1 000 разів менше, ніж вірусів гепатиту В. Проте  вважають, що попадання одного віріона ВІЛ в кров може спричинити розвиток  хвороби. 

За допомогою слини віруси  імунодефіциту людини не передаються, так як в ній міститься спеецифічний інгібітор ВІЛ, природа якого ще не встановлена. Це не лізоцим, не лакторферин або лактопероксидаза. Ось чому при орально-генітальних контактах майже немає збудника.

 

Особи груп високого ризику щодо ВІЛ інфікування

1.  Гомосексуалісти та чоловіки бісексуали.

2.   Наркомани, які використовують спільні голки.

3.   Люди, яким багаторазово переливали кров або продукти крові в період  між 1978 – 1985 роками.

4.   Сексуально нерозбірливі чоловіки і жінки, особливо повії.

5.                      Люди, які перенесли гепатит B, сифіліс та інші хвороби, що передаються статевим шляхом.

 

Лабораторна діагностика

Діагностика СНІДу базується  на клінічних проявах захворювання і результатах вірусологічних та імунологічних методів  дослідження. У разі ВІЛ-інфекції в організмі вірусоносіїв  або хворих на СНІД можна виявити такі вірусспецифічні маркери: антитіла до ВІЛ, інфекційний вірус,  вірусний антиген - у сироватці крові та інфікованих клітинах-мішенях (лімфоцити та ін.), провірус - у ДНК уражених імуноцитів.

Метою вірусологічного дослідження є встановлення етіологічного діагнозу на підставі виявлення вірусспецифічних маркерів.

 

 

Діагностика СНІДу – складна і відповідальна. Вона ґрунтується на основних клінічних проявах захво­рю­вання, а також результа­тах вірусологічних, серологічних та інших методів дослідження, і вимагає їх комплексної оцінки.

Серологічна діагностика. Сьогодні в Україні розроблена двоетапна си­с­те­ма лабораторної діагностики захворювання, яка включає дослідження сироватки крові людини на наявність антитіл проти ВІЛ. Сироватка крові осіб з підозрою на ВІЛ-носійство обстежується за допомогою ІФА. Це відбувається в спеціалізованих лабораторіях з діагностики СНІДу, які розгортаються на базах санепідстанцій, станцій переливання крові, поліклінік, диспансерів, інфекційних лікарень тощо.

Основним матеріалом для дослідження є кров. Її забирають із ліктьової вени в об’ємі 5 мл. Отриману пізніше сироватку можна зберігати при температурі 4 °С протягом 7 днів. Запропоновано також використання способу “сухої краплини”. Він полягає в тому, що за допомогою стерильної голки проколюють палець і декілька крапель крові наносять на стерильний диск, виготовлений з фільтрувального паперу. Висушені диски можуть зберігатись тривалий час (до 6 місяців) у полі­етиленових пакетах. У разі потреби за допомогою фосфатного сольового розчину імуноглобуліни переводять у рідкий стан і досліджують.

Доведено, що антитіла проти ВІЛ можна виявити в сльозах, слині, грудному молоці (IgA), спинномозковій рідині (в осіб з енцефалопатіями або неврологічною симптоматикою), навіть у сечі. Допустимим вважається дослідження на наявність антитіл рідини склоподібного тіла в трупів.

ІФА (в основному, непрямий) дозволяє визначити антитіла у будь-якому дослідженому матеріалі. Він є достатньо чутливим методом, що використовується у будь-яких лабораторіях світу. Антигени для цих тест-систем одержують або із заражених тканинних культур, або за допомогою рекомбінантних ДНК. В Україні використовують тест-системи “Антиген”, “Рекомбінант-ВІЛ”, “Скрин-ВІЛ”, “Комбі-ВІЛ”, фірми “Аbbott” та інші.

Слід відзначити, що антитіла у крові з’являються не зразу після попадання ВІЛ в організм, а не менш, ніж через 2-3 місяці, а деколи й довше (5-8 міс.), тому слід пам’ятати, що ІФА є малопридатною для діагностики вірусоносійства саме в сероне­гативний період. Одноразовий позитивний результат виявлення антитіл в крові не дає можливості підтвердити діагноз набутого імунодефіциту. Цю реакцію рекоменду­ють повторити тричі. Діагностичними вважаються два позитивних результати в трьох повторах. Така схема постановки реакцій зумовлюється тим, що сучасні ­тест‑системи все ж таки можуть давати як псевдопозитивні, так і псевдонегативні результати.

Зразки крові, які дали два позитивних результати з трьох повторів, направляють у спеціалізовані лабораторії при науково-дослідних інститутах для підтвер­дження наявності ВІЛ-вірусоносійства за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу – вестернблоту або імуноблоту (від англ. blott – пляма), реакції непрямої імунофлуоресценціїї або радіоімунної преципітації. Ці методи дозволяють виявити антитіла до певних вірусних білків.

Метод вестернблоту передбачає попереднє електрофоретичне розділення вірусних білків у поліакриламідному гелі з наступним переносом їх на спеціальні нітроцелюльозні мембрани. Після цього на фільтрах розганяються досліджувані зразки крові з подальшою ідентифікацією їх білків (антитіла проти певних структурних вірусних білків) за допомогою антивидових мічених сироваток. На нітроцелюльозних фільтрах з’являються кольорові смуги, що відповідають комплексам, утвореним вірусними структурними білками та антитілами сироватки вірусоносія. Про позитивний результат реакції може свідчити наявність антитіл проти вірусних білків р24, p31, gp41, gp120/160.

При негативних результатах на фільтрах не видно характерних зон забар­влення.

Одним із ефективних способів визначення наявності антитіл проти ВІЛ у си­роватці крові людини є використання реакції мікроаглютинації. Вона подібна до реакції непрямої гемаглютинації, однак замість еритроцитів, сенсибілізованих відповідним антигеном, тут використовують як основу частинки желатину або латексу. У випадку позитивного результату спостерігають за появою ­специфічного осаду в лунках планшет. Дана реакція дає подібні результати до ІФА, проте ­значно простіша за методикою постановки, швидше виконується, дає менше псевдопозитивних результатів.

Іншим методом виявлення антитіл проти ВІЛ є реакція непрямої імунофлуоресценції. Для постановки цієї реакції використовують антиген, який одержують з перещеплюваних ліній лімфоцитів, заражених вірусами імунодефіциту. З них готують препарати фіксованих клітин, які можна зберігати протягом 2 місяців при температурі -20 °С. У разі необхідності скельця з нанесеним антигеном обробляють розведеними досліджуваними сироватками (1:10, 1:100, 1:1000 тощо), а потім люмінесцентною антисироваткою проти імуноглобулінів людини. ­Препарати додатково контрастують синькою Еванса і вивчають у люмінесцентному ­мікроскопі.

Більш чутливим є метод радіоімунопреципітації. Як і при будь-якій імунологічній реакції в його основі лежить взаємодія антигенів ВІЛ з антитілами проти них. У цій реакції як антигени використовують білки ВІЛ, мічені радіоактивними ізотопами 125I або 35S.

Реакцію проводять у рідкій фазі, змішуючи гомологічні антигени (вірусні біл­ки gp120, gp41, p24, p17, p9 та інші) й антитіла (сироватка вірусоносія), внаслідок чого утворюються імунні комплекси. Вони взаємодіють із спеціальною системою, яка складається з білка А S. аureus, з’єднаного із сефарозою, внаслідок чого відбувається преципітація. Утворений комплекс за допомогою ультрацентрифугування осаджують у пробірках, видаляють надосадову рідину, залишаючи тільки субстрат антиген-антитіло-білок А-сефароза. На наступному етапі дослі­джен­ня викликають дисоціацію комплексів додецилсульфатом натрію, піддають їх електрофорезу в поліакриламідному гелі і за допомогою авторадіографії визначають молекулярну масу мічених ізотопами білків. Це дозволяє встановити, які саме вірусні білки знаходяться в імунних комплексах, отже, до яких вірусних білків утворюються антитіла. Цей метод є чутливішим, ніж імуноблот, проте вимагає спеціального обладнання, тому не використовується широко в лабораторній практиці.

Підсумовуючи вищевикладене, можна таким чином підійти до підтвердження діагнозу ВІЛ-носійства. Одноразовий негативний результат на наявність антитіл, одержаний за допомогою ІФА, дозволяє зробити висновок про відсутність ВІЛ-інфікування. Два позитивних результати з трьох повторних досліджень сироваток не дають змоги встановити діагноз вірусоносійства. Це можна зробити тільки після одержання позитивних результатів про наявність антитіл проти певних вірусних структурних білків за допомогою імуноблотингу або інших методів, що його замінюють.

Вірусологічна діагностика. Матеріалом для дослідження може бути кров, спинномозкова рідина, грудне молоко, сперма, біоптати при автопсії тощо. Для виявлення вірусу використовують електронну мікроскопію, зараження культур Т‑лімфоцитів (CD4-клітини). Для ідентифікації вірусів можливе використання високочутливих тест-систем ІФА, реакції непрямої імунофлуоресценції, характерної цитопатичної дії тощо.

Важливим для діагностики СНІДу є визначення провірусу в лімфоцитах, або вірусних нуклеїнових кислот у патологічному матеріалі. З цією метою широко використовують методи молекулярної гібридизації. Використання цього методу набуває важливого значення особливо через те, що серонегативний період при СНІДі може тривати декілька місяців. Висока чутливість запропонованого методу дозволяє виявити навіть поодинокі вірусні частинки в крові (0,1-1,0 нг нуклеїнових кислот). Принцип його полягає в тому, що в умовах in vitro викликається процес гібридизації між вірусною нуклеїновою кислотою (ДНК, РНК) та спеці­альним зондом, який мічений радіоактивним фосфором 32Р. Утворений комплекс достатньо легко можна ідентифікувати за допомогою авторадіографії. Однак використання 32Р-зондів у певній мірі ускладнює цей метод, оскільки вони мають короткий (2 тижні) період напіврозпаду, вимагають дотримання суворих правил техніки безпеки при роботі з радіоактивними ізотопами тощо. Враховуючи це, перспективним напрямком є використання зондів, які можна виявити за допомогою кольо­рових ферментативних реакцій. Такою міткою є біотин (біотиновий зонд).

Існують різноманітні варіанти молекулярної гібридизації, серед яких найчастіше застосовуються точкова гібридизація, блот-гібридизація, сандвіч-гібридизація, гібридизація in situ (в заражених тканинах).

Одним з варіантів молекулярної гібридизації розглядається полімеразно-ланцюгова реакція, в основі якої лежить ампліфікація генів. Використання ДНК-полі­мерази, наприклад, з Thermophylus aquaticus дозволяє за кілька циклів ампліфікації значно збільшити кількість досліджуваних нуклеїнових кислот, внаслідок чого їх можна виявити будь-якими відомими методами – ІФА, електрофорез у полі­акриламідному гелі тощо. Ця реакція суттєво перевищує чутливість попереднього методу (на декілька порядків), тому може бути використана при дослідженні мікрооб’ємів матеріалу або таких тест-об’єктів, де іншими методами віруси імунодефіциту не виявляються, наприклад, змиви з носоглотки, слина.

Крім описаних методів діагностики, допустимим визнається виявлення антигенемії, яка зумовлена білком р24. Цей р24-антиген можна визначити за допомогою модифікованих методів ІФА.

Одержання позитивного результату при застосуванні одного з наведених методів є достатнім аргументом для встановлення етіологічного діагнозу ВІЛ-інфекції.

Вірусологічна діагностика СНІДу – достатньо складний процес, доступний для виконання тільки у високоспеціалізованих лабораторіях, де створюються всі необхідні умови для роботи (захист персоналу від зараження під час культивування, очищення та концентрування ВІЛ) і є висококваліфіковані фахівці.

Таким чином, при наявності ВІЛ-інфекції у вірусоносіїв або хворих на СНІД можна виявити такі вірусспецифічні маркери: антитіла до ВІЛ, безпосередньо інфекційний вірус, провірус у ДНК уражених імуноцитів, вірусний антиген у сироватці крові та інфікованих клітинах-мішенях.

 

На першому етапі проводять скринінг сироватки крові на антитіла до ВІЛ за допомогою  різних тест-систем імуноферментного аналізу (ІФА).

 

Забір хворого у вірусоносія

 

 Кров донорів досліджують у лабораторіях з діагностики СНІДу, розгорнутих на базі станцій (відділень) переливання крові, а кров осіб, які належать до групи ризику, - у лабораторіях з діагностики СНІДу  різних медичних  закладів (диспенсери, СЕС, протичумні станції, лікарні, поліклініки, діагностичні центри тощо). Крім того, дослідження сироватки крові в ІФА на антитіла до ВІЛ частково проводять  у лабораторіях клінічної імунології, розгорнутих на  базі інфекційних лікарень.

 

ІФА

 

На другому етапі сироватки крові, позитивні в ІФА (два позитивні результати з дфвох або трьох досліджень), направляють у лабораторії спеціалізованих НДІ, діагностичні центри для досолідження за допомогою підтверджуючих тестів: імуноблоту (вестерн-блоту), тесту радіоімунної преципітації (РІП) і реакції непрямої імунофлюоресценції (РНІФ).

 

Імуноблот

 

Одержання позитивного результату під час  дослідження методом імуноблоту або РІП, тобто виявлення антитіл до певних структурних білків ВІЛ, дає змогу зробити позитивний висновок про янаявність ВІЛ-інфекції, хоча можливі випадки несправжньопозитивних реакцій. Аналогічний висновок можна зробити також у разі одержання позитивних результатів дослідження сироваток крові на антитіла до ВІЛ у РНІФ, використовуючи культури Т-лімфоцитів, інфікованих ВІЛ, тобто ті, що містять вірусний антиген.

Крім зазначеної двоетапної схеми лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції на підставі виявленння противірусних антитіл застосовують також альтернативін методи вірусологічної діагностики:

*                        виявлення антигена ВІЛ у сироватці крові  за допомогою ІФА та інших тестів;

*              виділення ВІЛ у культурах лімфоцитів із подальшою індикацією вірусу за ЦПД      (утворення синцитіїв), ревертазною активністю та детекцією вірусного антигену (або провірусу в молекулярній гібридізації in situ);

*                        детекція провірусув лімфоцитах периферичної крові у тесті молекулярної гібридізації.

Ці методи використовують головним чином у лабораторіях спеціалізованих НДІ, де є певні умови для роботи (наприклад, захист персоналу від зараження під час культивування, очищення та концентрування ВІЛ) і висококваліфіковані фахівці.

Одержання позитивного результату під час  застосування одного з наведених методів є достатнім аргументом для встановлення етіологічного діагнозу  ВІЛ-інфекції.

На відміну від класичних методів серологічної діагностики вірусних захворювань, для діагностики ВІЛ-інфекції проводять індикацію специфічних антитіл  до поверхневих антигенів у окремих сироватках.

 

Лікування

Лікування СНІДу - надзвичайно важлива проблема, яка, на жаль, далека від остаточного розвязання.  В залежності від особливостей репродукції вірусів можна передбачити різні способи втручання в його життєвий цикл.

 

Деякі експериментальні підходи до терапії СНІДу

I. Попередження прикріпленню ВІЛ до клітин господаря.

Приклади: 1. Декстран сульфат – негативно заряджений полісахарид; ймовірно конкурує із рецепторами ВІЛ і CD4.

2. Розчинний CD-4, який продукується in vitro і зв’язується з протеїном для продовження його перебування в кров’яному руслі; з’єднується з вільними вірусами і перешкоджає прикріпленню їх до клітин господаря.

 

II. Пригнічення вірусних ферментів.

Приклади: 1. Zidovudine та ін. зв’язуються із зворотною транскриптазою і блокують синтезом вірусної нуклеїнової кислоти.

2. Препарати, які блокують дію ферменту, що сприяє видаленню вірусної оболонки, а пізніше забезпечує включення білків до складу віріону.

 

III. Блокування трансляції матричної РНК

Приклад:   1. Короткі фрагменти RNA, комплементарні сегментам матричної РНК ВІЛ, специфічно з ними взаємодіють і зупиняють синтез вірусного протеїну. ВІЛ, створений генно-інженерними методами, вводиться в клітини, уражені ВІЛ, і блокує утворення РНК.

 

IV. Цілеспрямоване знищення заражених ВІЛ клітин

Приклад:   1.  Токсин Pseudomonas приєднується до синтезованих в умовах лабораторії  CD-4. CD-4 забезпечує приєднання токсину до заражених клітин, взаємодіючи з вірусними антигенами gp 120 на їх поверхнях.

 

V.  Використання імплантованих генів.

Приклад:   1.  У клітини кісткового мозку від хворого на СНІД інтегрується лабораторно зконструйований ген, який перешкоджає активації провіруса. Клітини вводять в організм хворого,  де вони розмножуються, забезпечуючи популяцію клітин, які не можуть продукувати інфекційний ВІЛ.

Ця ідея відпрацьована на попередженні  експериментальної інфекції, що викликаєть вірусом простого герпесу у мишей.

 

VI.            Підвищити чутливість вірусу до ультрафіолетового опромінення.

Приклад:   1. Хворий на СНІД отримує препарати, які підвищують чутливість уражених ВІЛ клітин до дії УФО. Мононуклеарні клітини видаляються з організму, опромінюються  і вводяться назад в організм хворого. Інфіковані опромінені клітини руйнуються в організмі.

 

VII. Використання імуностумуляторів.

Приклади: 1. Інтерферон, синтезований in vitro, який вводиться в організм хворого в малих дозах,  блокує вивільнення вірусів з інфікованих клітин. Це істотно підсилює ефект zidovudine.

α-інтерферон також ефективний проти багатьох випадків саркоми Kaпоші.

2.  Ditiocarb, який хімічний подібний до одного із сільськогосполарських фунгіцидних препаратів, збільшує опір резистентність до вторинних інфекцій. Воно може також призначатись разом із зідовудином.

 

VIII. Порушити збирання і вихід віріоів з клітини можна за допомогою a-інтерферону, амплігену ( індуктора інфтерферону), інгібіторів або модифікаторів функцій протеаз, інгібиторів глікозування білків.

 

 

АНТИРЕТРОВІРУСНІ  ПРЕПАРАТИ

Антиретровірусні препарати застосовують для терапії і профілактики ВІЛ-інфекції/ СНІДу. Існує 3 класи АРВП:

1) нуклеозидні інгібітори зворотної транскриптази ВІЛ (Nucleoside Analog Reverse Transcriptase Inhibitors —NARTIs).

2) ненуклеозидні інгібітори зворотної транскриптази ВІЛ (Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors — NNTRIs);

3)      інгібітори протеази ВІЛ.

 

Призначений пре­парат не виліковує від СНІДу і не запобігає зараженню ВІЛ, проте сприяє зменшенню розмноження вірусу і захищає імунну систему від ушкодження. Це призводить до більш повільного розвитку проявів, характерних для СНІДу і ВІЛ-інфекції.

 

НУКЛЕОЗИДНІ ІНГІБІТОРИ ЗВОРОТНОЇ ТРАНСКРИПТАЗИ ВІЛ

аналоги тимідину — зидовудин, фосфазид, ставудин;

аналог аденіну — диданозин;

аналоги цитидину— залцитабін, ламівудин;

аналог гуаніну — абакавір.

 

Механізм дії. В основі структури всіх нуклеозидних інгібіторів зворотної транскрип­тази ВІЛ (НІЗТ) лежить один з аналогів природного нуклеозиду (тимідин, аденін, цитидин або гуанін), що обумовлює загальну властивість метаболітів кожного з препаратів бло­кувати зворотну транскриптазу (ЗТ) ВІЛ і вибірково інгібувати реплікацію провірусної ДНК. Під дією відповідних ферментів препарати метаболізуються з утворенням трифос-фатів, які й виявляють фармакологічну активність. Здатність препаратів цієї групи інгібувати ЗТ ВІЛ у сотні разів вища, ніж здатність пригнічувати ДНК-полімеразу людини. НІЗТ активні в інфікованих ВІЛ Т-клітинах і макрофагах, інгібують важливу стадію життєвого циклу вірусу, що проходить за участю ЗТ ВІЛ — зворотну транскрипцію геному.

 

Механізм дії зидовудину

 

НЕНУКЛЕОЗИДНІ ІНГІБІТОРИ ЗВОРОТНОЇ ТРАНСКРІПТАЗИ ВІЛ

  Невірапін

  Делавердин

 Іфавіренц.

  Вони інгібують ЗТ і, відповідно, стадію зворотної транскрипції при реподукції ВІЛ. Високоспецифічні до ЗТ ВІЛ і не блокують ДНК-поліиеразу людини.

 

Спектр активності. Клінічне значення має активність ННІЗТ у відношенні ВІЛ-1. У той же час, проти ВІЛ-2 препарати даної групи неактивні.

 

ІНГІБІТОРИ ПРОТЕАЗИ ВІЛ

До інгібіторів протеази ВІЛ належать саквінавір, індинавір, ритонавір, нелфінавір і ампренавірі                                                                 

 

Механізм дії. Протеаза ВІЛ — фермент, необхідний для протеолітичного роз- щеплення поліпротеїнових попередників вірусу на окремі білки, що входять до склад; вірусу. Розщеплення цих вірусних поліпротеїнів вкрай важливе для дозрівання вірусу здатного до інфікування, тобто інфекційне активного вірусу. Інгібітори протеази BІЛ (ІП) блокують активний центр ферменту і порушують утворення білків вірусного капсиду. Препарати цієї групи пригнічують репродукцію ВІЛ, у тому числі при резистентності до інгібіторів ЗТ. У результаті інгібування активності ВІЛ-протеази формуються незрілі вірусні частки, нездатні до інфікування інших клітин.

 

В лікуванні СНІДу широко застосовуються імуномодулятори левамізол,  ізопринозин, гормони тимуса (тимозин, тимопентин), інтерлейкін-2, індометацин, інтерферон та його індуктори. Використовується імунозамісна  терапія - зрілі тимоцити, трансплантація кісткового мозку, трасплантація фрагментів тимуса.

 

Профілактика

Найліпшим способом боротьби з будь-якою інфекційною хворобою є її запобігання. Вакцинація - найпростіший , безпечний та єфективний метод попередженя хвороби, і за допомогою вакцин було досягнуто великих успіхів у боротьбі з віруснимиінфекціями. Саме завдяки вакцинації було практично переможено віспу та поліомієліт. Зниження захворюваності на жовту гарячку, кір, паротит та краснуху досягнуто також в основному завдяки вакцинації.  На фоні цих успіхів загроза з боку ВІЛ є надзвичайносерйозною. Зараз створення  вакцини проти СНІДу  є, напевно, найважчим та невідкладним завданням серед тих які стоять перед вірусологами.

 

Вакцини проти СНІДу

Тип вакцин	Тип імуногену	Імуногени, які перевірено на людях
Вбитий вірус	Цільні або зруйновані інактивовані вірусні частки ВІЛ без генетичного матеріалу	Цільний інактивований ВІЛ у заражених людей
Фрагменти ВІЛ з адювантом	Оболонка ВІЛ, фрагменти білків оболнки або інших антигенів, синтезованих штучно або клітинами, одержаними методами генної інженерії	gp 160,  gp 120, p 17
Ген ВІЛ у вірусному векторі	Ген білку оболонки ВІЛ у вірусі вісповакцини або аденовірусі або клітини, які заражено рекомбінантним вірусом ВІЛ/вісповакцина	Рекомбінантний вірус ВІЛ/вісповакцина і заражені ним клітини
Антиідіотипова вакцина	Антитіла проти CD4	Антитіла проти CD4

 

 

 

Деякі шляхи зменшення ризику зараження на СНІД

1. Утримання від сексуального стосунків – ефективний, але не широко використовуваний засіб.

2.   Залишайтеся з одним вірним сексуальним партнером. Використовуйте свою енергію в близьких стосунках з однією персоною, замість багаторазових поверхневих взаємин.

3.   Використовуйте латексні презервативи із спермицидною активністю. Не використовуйте інших видів презервативів. Презервативи істотно зменшують, але не виключають ризик зараження ВІЛ.

4.        Не займайтесь анальним сексом. Він особливо ризикований.

5.        Уникайте травм статевих органів і прямої кишки. Маленькі розриви шкіри і слизових оболонок сприяють передачі ВІЛ.

6.        Уникайте голок та інших об'єктів, забруднених кров’ю когось-іншого.

7.   Відстрочте вагітність на невизначений термін, якщо ви жінка, заражена ВІЛ. Якщо ви не впевнені, обов’язково здайте кров для виключення інфікування ВІЛ перед вагітністю. Біля 30% малюків, народжених до заражених ВІЛ матерів, помре СНІДу.

8.        Не майте статевих контактів з особою, яку ви погано знаєте.

9.        Не майте статевого контакту з особою, яка знаходиться в групі ризику.

10.       Не майте статевих контактів з особами, у яких є виразки ураження від вірусу простого герпесу або з інших причин. Вони сприяють передачі ВІЛ.