Экспериментальная часть

Реактивы: Биуретовый реактив, хлорид натрия (0,9%), стандартный раствор альбумина (10%).

Приготовление биуретового реактива: Растворяем последовательно в мерной колбе на 250мл 0,375 г СиSО₄ х 5Н₂О и 1,5г сегнетовой соли (KNaC₄H₄O₆ ) в 150 мл воды.

Приливают медленно при постоянном перемешивании 75мл 10% гидроксида натрия и доводят содержимое до 250мл водой. Биуретовый реактив не подлежит длительному хранению в стеклянной посуде.

Приготовление стандартного 10%-ного раствора альбумина: стандартный 10%-ный раствор альбумина готовят из 40% - ного раствора сухого альбумина, растворяя его в соответствующемколичестве физиологического раствора, который должен содержать в 1мл 0,1 г белка.

Оборудование: Микропипетки и пипетки (1 мл и 5 мл), штатив с пробирками, стеклянные палочки, фотоэлектроколориметр (ФЭК), спектрофотометр (СФ).

Материалы: Сыворотка крови, раствор альбумина (10%).

Ход работы: Для определения содержания белка в сыворотке крови или в других объектах, содержащих белок, необходимо построить калибровочный график. Для этого применяют стандартный белок – кристаллический альбумин сыворотки крови.

Схема разведения альбумина для построения калибровочного графика приведена в таблице:

№ пробирки	Стандартный 10%-ный раствор альбумина, мл	0,9%-ный раствор хлорида натрия, мл	Концентрация белка, г/л	Экстинкция
0 1 2 3 4	0,2 0,4 0,6 0,8 1	0,8 0,6 0,4 0,2 -	20 40 60 80 100

Из каждой пробирки с разведенным стандартным раствором альбумина берут по 0,1 мл раствора и добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием. Через 30 мин. измеряют экстинкцию каждой пробы на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9%-ного раствора NaCl + 5,0 мл биуретового реактива) в кювете толщиной 1 см, длина волны 540-560 нм (светофильтр зеленый).

По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения экстинкции, по оси абсцисс – концентрацию белка.

Берут 2 пробирки – в одну наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную)-0,1 мл раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое перемешивают встряхиванием.

Через 30 мин. измеряют экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора.

Содержание белка в сыворотке крови находят по калибровочной кривой или по формуле:

D_оп C_ст

С _опыт = _______________________ (г%)

D_ст

где D_оп – поглощение опытной пробы, D_ст-поглощение стандартного раствора белка, Cст – концентрация белка в стандартном растворе, г%.

Спектрофотометрический метод определения содержания белка в сыворотке крови

Метод основан на светопоглощении при 280 нм ароматических радикалов тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина, содержащихся в белке. Однако при данной длине волны поглощают и нуклеиновые кислоты, хотя их максимум абсорбции приходится на 260 нм. Поэтому измерение экстинкции раствора проводят при 260 и 280 нм, чтобы сделать поправку на примесь нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Метод неприменим к материалу, где содержание нуклеиновой кислоты превышает 20%.

Ход определения. В пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и добавляют 9,9 мл раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой.

Измеряют экстинкцию исследуемого раствора против контрольного раствора хлорида натрия на спектрофотометре в кювете толщиной 1 см при двух длинах волн – 260 и 280 нм.

Р а с ч е т можно проводить по формуле, эмпирически полученной Калькаром (поэтому можно не прибегать к калибровочному графику):

Х = 1,45Е₂₈₀ – 0,74Е₂₆₀, где х – концентрация белка в растворе, г/л

Оформление работы: По калибровочной кривой рассчитать содержание белка. Сравнить результаты, полученные биуретовым методом и спектрофотометрическим. Сделать вывод о наличии отклонения концентрации белка в исследуемой сыворотке крови от нормы и о возможных его причинах.

Контрольные вопросы:

1. Объясните принцип биуретового метода определения содержания белка в сыворотке крови.

2. Каковы нормальные значения концентрации общего белка в сыворотке крови?

3. Назовите причины, вызывающие отклонения от нормы общего содержания белка в сыворотке крови.