Типы культуральных систем

Непроточные культуры. Обычный тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. Эти системы пригодны для куль­тивирования клеток как в монослое, так и в суспензии. По мере роста клеток в среде культивирования происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов - следовательно, среда должна по­стоянно меняться, что, в свою очередь, приводит к изменению клеточно­го метаболизма (физиологической дифференцировке). Системы непро­точных культур характеризуются в той или иной степени накоплением отходов и непостоянством внешних условий.

Способы увеличения продолжительности жизни культур:

а) прерывистый - часть культуры заменяется равным объемом све­жей среды;

б) постоянный - объем культуры постоянно увеличивается с низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются;

в) перфузионный - постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной бесклеточ- ной среды.

Проточные культуры. Проточные культуры обеспечивают истин­ные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Это единственная система, в которой все клетки гомогенны и сохраняют гомогенность в течение длительно периода, что имеет очень важное значение в физиологических исследованиях. Однако использование таких культур для получения кле­точных продуктов невыгодно с экономической точки зрения. Системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микро­носителях.

Монослойные культуры

Требования к поверхности субстрата. Большинство нетрансформи- рованных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату: к другим клеткам либо к стеклу (алюмоборосиликатное стекло, чаще модифицированное), пластику (по­листирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целло­фан и другие при условии правильной обработки этих полимеров - пла­стиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клет­ки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу (качественная нержавеющая сталь или титан).

Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культу­ральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхно­стной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеинами (наиболее изученным является фибронектин, присутствующий в сыво­ротке и других физиологических жидкостях), а также присутствие двух­валентных катионов кальция и магния. Суммарный отрицательный заряд поверхности субстрата (например, за счет образования отрицательно за­ряженных карбоксильных групп) может достигаться предварительным воздействием химическими (окисляющие агенты) и физическими факто­рами (высоковольтный разряд, облучение УФ), что облегчает электро­статическое прикрепление клеток. Поверхность культурального сосуда может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление кле­ток. К природным субстратам, на которых растут клетки, относятся коллаген и желатин. Для этих целей используют коммерческие препараты коллагена для культуры тканей (например, «Витроген 100»), что позволяет избежать утомительной процедуры получения коллагена из крысиных хвостов.

Культуральная посуда. Монослойное культивирование осуществ­ляют во флаконах (флаконы Ру - самые большие стационарные флаконы поверхностью до 200 см²) или пробирках для культуры тканей, обеспе­чивающих поверхность роста 5-200 см .

Рост клеток в монослое. В случае монослойных культур необходи­мо проводить систематические пассажи клеток, используя для этого культуры предыдущего рассева или музейные клетки, сохранившиеся в условиях консервации. Полноценная популяция может быть получена только от генерации, состоящей из жизнеспособных клеток. Поэтому просмотр и оценка качества монослоя имеют решающее значение при выборе культур для пересева.

Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Когда две клетки приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфи­ческие движения клеточной мембраны. Первичные клетки, следователь­но, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений. Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюда­ется также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в та­ком покоящемся состоянии, но если их не пересеять, они погибают. Из сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способно­стью снимать контактное торможение.

Снижение распластывания клеток при достижении полного моно­слоя, а также ошаривание и прекращение роста клеток при их открепле­нии от подложки легли в основу представлений о тесной связи распла­стывания нетрансформированных клеток по мере их роста.

Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки, трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности. Считается, что эти клетки утрачивают за­висящую от плотности регуляцию. Трансформированные клетки способ­ны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не на­ступает смена среды, то клетки быстро погибают.

Одним из факторов, лимитирующим рост клеток, является истощение в среде необходимых питательных компонентов. Следовательно, для по­лучения высокой плотности клеток необходима периодическая замена питательной среды, а это может приводить к постоянному изменению состава среды, омывающей клетки, что весьма нежелательно.

Процесс подготовки клеточного монослоя к отделению от стекла и формированию суспензии (обработка клеток в монослое 0,02 % раство­ром химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА) происходит при комнатной температуре в течение 5-10 мин в зависимости от типа культуры и ее индивидуального состоя­ния. Как только клеточный монослой достаточно разрыхляется и начина­ет отделяться от стекла, раствор фермента сливают, а в культуральную посуду заливают определенное количество ростовой среды. Этой средой тщательно смывают клетки со стенки сосуда и легким пипетированием способствуют образованию гомогенной взвеси. Полученную взвесь по­сле подсчета числа клеток разводят ростовой средой до посевной дозы и используют при новых пересевах.

Монослойные культуры имеют ряд преимуществ, являющихся пред­посылками их широкого использования:

1. выделение секретируемого продукта многими клетками осуществ­ляется эффективнее в случае их прикрепления к субстрату;

2. возможность быстрой и легкой замены питательной среды, сопос­тавления времени и количества среды с периодом роста клеток или вре­менем наработки продукта;

3. обеспечение наибольшей гибкости исследований, поскольку в мо­нослой могут быть введены любые типы клеток;

4. достижение искусственно высокой плотности клеток с использо­ванием перфузионной техники;

5. возможность использования одной и той же аппаратуры с разным отношением клетки-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.

Однако при использовании монослойных культут выявляются и не­достатки:

1. сложность масштабирования;

2. отсутствие информативности визуального анализа;

3. трудности с определением и поддержанием таких параметров, как кислотность и содержание О2, и обеспечением гомогенности культуры клеток;

4. необходимость значительных пространств.