Визначення активності лужної і кислої фосфатази в змішаній слині

Фосфатази — ферменти, які каталізують відщеплення фосфорної кислоти від її органічних ефірних з'єднань. В залежності від реакції середовища, при якому фермент виявляє активність, розрізняють декілька її видів.

Клінічне значення мають дослідження рівня активності лужної фосфатази з максимумом активності при рН 10,0 і кислої з оптимумом рН 4,8.

Принцип методу заснован на здатності фосфатази слини за певних умов гідролізовати ефірний зв'язок у паранітрофенілфосфаті. Паранитрофенол, що звільнився у лужному середовищі дає жовте фарбування. Інтенсивність фарбування відображає активність ферменту.

Реактиви і устаткування. 1. Субстратний розчин паранітрофенілфосфату (натрієвої солі) готують у момент проведення реакції з розрахунку 1 мг препарату в 1 мл дистильованої води. 2. 0,15 М аміачний буфер (рН 10,0), застосований для визначення лужної фосфатази, готують шляхом змішування 85 мл 0,15 М NH₄OH і 15 мл NH₄C1. Перевіряють рН розчину за допомогою потенціометра. Розчин зберігають при t= +4° С. 3.0,2 М ацетатний буфер (рН 4,8) використовується при визначенні кислої фосфатази. Буферний розчин готують шляхом змішування 40 мл 0,2 М розчину оцтової кислоти і 60 мл 0,2 М оцтовокислого натрія. рН перевіряють потенціометрично. Зберігають розчин у холодильнику при t= +4° С. 4. Стандартний розчин паранітрофенола, використовують для будови каліброваної кривої. 6,96 мг паранітрофенола розчиняють у 0,02 н розчині їдкого натрію до 1000 мл. 5.1,0 н і 0,02 н розчини їдкого натрію. 6. Змішана слина. 7. Спектрофотометр СФ-4, СФ-4А, СФ-16. 8. Водяний ультратермостат. 9. Секундомір. 10. Аналітичні ваги. 11. рН-метр. 12. Центрифуга.

Хід визначення

Лужна фосфатаза. У дві хімічні пробірки вносять по 0,8 мл 0,15 М аміачного буфера (рН 10,0) і 0,5 мл субстрату паранітрофенілфосфата, проби поміщають у водяний термостат при температурі 37° С. Потім в одну з пробірок (дослідну) додають 0,2 мл слини. Друга пробірка служить контролем на реактиви. Проби інкубують 60 хв при 37° С. По закінченні терміну інкубації в пробірки додають 0,5 мл 1,0 н розчину їдкого натрію, а в контрольну пробу вносять 0,2 мл слини. Обсяг проб доводять до 5,0 мл дистильованою водою. Вміст пробірок ретельно перемішують і фотометрують при довжині хвилі 400 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм проти відповідного контролю.

Кисла фосфатаза. Хід аналізу точно такий же, що і при визначенні лужної фосфатази, але з тією відмінністю, що для аналізу беруть 0,1 мл слини і замість аміачного буфера використовують 0,2 М ацетатний буфер, рН 4,8.

Побудова каліброваної кривої. 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мл стандартного розчину (п. 4), що містять відповідно 0,05—0,25 мікромолей (мкмолей) паранітрофенола, за допомогою 0,02 і розчину їдкого натрію доводять до обсягу 5,0 мл і вимірюють оптичну щільність на спектрофотометрі проти 0,02 н розчину їдкого натрію. На підставі отриманих результатів будують калібровану криву, відкладаючи на осі ординат значення показників оптичної щільності при 400 нм, а на осі абсцис — кількість мкмолей паранітрофенола. Цифровий матеріал для побудови каліброваної кривої представлений у таблиці.

Таблиця

Кількість паранітрофенола (мікромолі)	Оптична щільність Е400
0,05	0,177
0,10	0,350
0,15	0,537
0,20	0,716
0,25	0,890

Приклад розрахунку. Активність фосфатази (кислої, лужної) слини виражається в наномолях (нмолях) паранітрофенола звільненого з паранітрофенілфосфата під впливом 1 мл слини за 1 хв при температурі 37° С.

Показник оптичної щільності проб, у яких містилося 0,2 (0,1) мл слини, зіставляють з показниками каліброваної кривої і знаходять кількість паранітрофенола, що освободились за 60 хв інкубації.

Е₄₀₀ проби лужної фосфатази дорівнює 0,06, що відповідає, згідно кривої, 0,016 мкмолей паранітрофенола.

Е₄₀₀ проби кислої фосфатази відповідає 0,375, що дорівнює згідно кривої 0,105 мкмолей паранітрофенола.

0,2 — мл узятої в дослід слини для лужної фосфатази;

0,1 —мл узятої в дослід слини для кислої фосфатази;

60 — час інкубації в хв;

1000 — коефіцієнт перерахування одиниць активності ферменту в наномолях паранітрофенола.

Отже, активність лужної фосфатази дорівнює:

(0,016 х 1000) / (60 х 0,2) = 2,7 нмоль паранітрофенола/хв/мл

Активність кислої фосфатази слини дорівнює:

(0,105 х 1000) / (60 х 0,1) = 17,5 нмоль паранітрофенола/хв/мл.

Важливу інформацію про визначення активності фосфатаз слини дає визначення її активності на мг білка слини. Для обчислення питомої активності отриманий результат поділяють на кількість мг білка в 1 мл слини, що визначалося по методу Лоури. У даному зразку слини в 1 мл містилося 1,3 мг білку. Отже, питома активність лужної фосфатази відповідає 1,9 нмолей паранітрофенола/хв/мг, а питома активність кислої фосфатази - 12,5 нмоль паранітрофенола/хв/мг білка.

У нормі активність кислої фосфатази слини коливається від 8,6 до 21,0 нмоль паранітрофенола/мл слини/хв, лужний - від 1,8 до 5,8 нмоль паранітрофенола/мл слини/хв, Межі коливань питомої активності кислої фосфатази відповідають від 5,6 до 19,2 нмоль паранітрофенола/мг білки/хв, а лужної - рівні від 1,8 до 5,2 нмолей паранітрофенола/мг білка/хв.

Активність кислої і лужної фосфатази слини при хронічному тонзиліті знижується, при пародонтозі активність кислої фосфатази знижується, а активність лужної не міняється. При виразковій хворобі і хронічних гастритах активність кислої і лужної фосфатази слини знижується

Питання для самоконтролю.

Біологічна роль слини, функції слини.

Роль слинних залоз у системі травлення.

Хімічний склад, фізико-хімічні властивості слини

Органічні компоненти слини

Неорганічні компоненти слини.

Ферменти слини.

Гормони і інші біологічно активні речовини слини, їх роль.

Клінічне значення дослідження слини.

Хімічна будова і склад твердих тканин зуба.

Шляхи надходження речовин у тверді тканини зуба і проникність емалі.

Поверхневі утворення на зубах.

Тестові завдання для самоконтролю.

1.У дитини спостерігається порушення процесів окостеніння і точечність емалі. Обмін якого мікроелемента при цьому порушений?

A. Фтору B. Заліза C. Цинку D. Хрому E. Міді

2.У хворого спостерігається прогресуюча демінералізація емалі, рН слини складає 6,0. Вживання якої їжі варто обмежити?

A. Вуглеводної. B. Білкової. C. Ліпідної.

D. Збагаченої вітамінами E. Збагаченої ненасиченими жирними кислотами

3.У комплексному лікуванні пародонтита використовують токоферол. Який ефект визначає лікувальні властивості цього вітаміну?

A. Антиоксидантний B. Протизапальний

C. Протиалергійний D.Остеотропний. E. Прооксидантний

4.Системні захворювання часто супроводжуються змінами вмісту в слині різних метаболітів. Концентрація якої речовини буде підвищеною в слині хворого цукровим діабетом?

A. Глюкози B. Сечовини C. Альбуміну

D. Креатинину E. Іонів цинку.

5.У хворого спостерігається інтенсивна гіперсалівація, що визначає часткову нейтралізацію хлорної кислоти в шлунку. Розщеплення яких речовин при цьому буде порушено?

A. Білків B. Вуглеводів C. Нуклеїнових кислот.

D. Ліпідів E. Холестерину

6.У дитини встановлена гостра ниркова недостатність. Якими біохімічними показниками слини це можна підтвердити?

A. Підвищенням рівня залишкового азоту.

B. Збільшенням концентрації імуноглобуліну А.

C. Зниженням рівня лужної фосфатази

D. Збільшенням вмісту α-амілази

E. Зменшенням рівня фосфату.

7.Надлишкова концентрація глюкози в слині при цукровому діабеті приводить до розвитку.

A. Множинного карієсу. B. Гіперплазії емалі C. Гіпоплазії емалі.

D. Флюорозу E. Посиленої кальцифікації емалі

8.У нормі рН слини складає 6,4 — 7,8. Порушення рН у лужну сторону (7,8) створює умови для:

A. Надходження іонів кальцію і фосфору в тканини зуба

B. Демінералізації емалі.

C. Виходу кальцію з тканини зуба

D. Виходу фосфору з тканини зуба.

E. Зниження стійкості тканини зуба до дії карієсогених факторів.

9.У нормі рН слини складає 6,4 — 7,8. Порушення рН слини в кислу сторону(6,2) приводить до:

A. Демінералізації емалі і розвитку карієсу

B. Кальцифкації тканини зуба. C. Флюорозу

D. Мінералізації тканини зуба. E. Підвищення стійкості тканини.

10.Захисна функція слини визначена декількома механізмами, у тому числі наявністю ферменту, що робить бактерицидну дію, здійснюючи лізис полісахаридного комплексу оболонки стафілококів, стрептококів. Назвіть цей фермент

A. Лізоцим B. α-амілаза C. Олиго-1,6-глюкозидаза

D. Колагеназа E. -Глюкуронідаза.

11.Зниження активності якого ферменту слини служить показником гіпофункції привушної залози?

A. Амілаза B. Мальтаза C. Лізоцим

D. Глюкокиназа E. Фосфатаза

12.Який мікроелемент найбільше ефективен при лікуванні системного карієсу?

A. Селен B. Барій C. Стронцій D. Залізо E. Мідь

Список використованої літератури.

1. Протеолиз в норме и при патологии Веремеенко К.Н., Голобородько О.Н., Кизим А.И. // Киев «Здоровье», 1988 – 200с.

2. Методы определения фкрментов слюны // Методические рекомендации / Киев, 1979 – 20с.

3. Слюнные железы. Биохимия, физиология, клинические аспекты / Тарасенко Л.М., Суханова Г.А., Мищенко В.П. и др. / Томск: Изд-во НТЛ, 2002 – 124с.

4. Юхновец Р.А., Чечель А.П. Свободные аминокислоты смешанной слюны человека в норме и при пародонтозе // Стоматология. – 1974. - №4 – С.12-13.