29)Подбор и селекция штаммов-продуцентов в биотехнологии. Понятие о технологичности штамма

В селекции продуцентов ферментов используются как традиционные в селекции микроорганизмов подходы (мутагенез и ступенчатый отбор на сверхсинтез), так и методы генной инженерии (получение генетических рекомбинантов и клонирование генов). Все эти методы традиционно на­ правлены на изменение или полное снятие регуляции синтеза ферментов. Известно, что эта регуляция осуществляется на пяти основных стадиях:

1) связывание РНК-полимеразы и инициация транскрипции;

2) индукция или дерепрессия транскрипции;

3) катаболитная репрессия транскрипции;

4) связывание рибосом и стабильность мРНК;

5) проникновение фермента через мембрану и стенку клетки с по­ следующим процессингом (если это внеклеточный фермент).

Мутанты по РНК-полимеразе легко выделяют с помощью селекции на антибиотикоустойчивость (например, к рифампицину или стрептоли­ дигину). Такой подход использовался в получении продуцентов α-амилазы у B. subtilis. Нарушение синтеза данного фермента происходило, очевид­ но, вследствие изменения узнавания мутировавшей РНК-полимеразой промоторов для генов α-амилазы.

Индукция или репрессия ограничивают экспрессию многих оперонов внеклеточных ферментов. Соответственно мутации, приводящие к устра­ нению потребности в индукторе либо снимающие репрессию, обеспечи­ вают конститутивный синтез данного продукта. Так, фенил-β-D-галактозид можно использовать для отбора на конститутивный синтез β-D-галак­ тозидазы у E. coli. Примером получения продуцента промышленного мас­ штаба может служить синтез глюкоизомеразы у Streptomyces phaechromogenes. Этот фермент используется для метаболизма ксилозы и ликсозы, однако ликсоз не индуцирует его синтез.

Мутанты, нечувствительные к катаболитной репрессии, представ­ ляют ценность в нескольких отношениях. Во-первых, они синтезируют фер­ менты на ранних стадиях ростового цикла культуры. Во-вторых, они всегда секретируют ферменты на более высоком уровне и допускают использование дешевых субстратов. Такие мутанты получают несколькими путями:

• простой отбор мутантов на агаризованных средах, содержащих высокие концентрации глюкозы или глацерола;

• путем селекции на рост в присутствии антиметаболитов, например целлобиозы. Таким путем были получены, например, продуценты глюко­ зидазы из Trichoderma;

• отбор на способность к спорообразованию в присутствии глюкозы путем пасеризации культур. Так, мутанты Actinomyces fradiae дерепрес­ сированы в отношении спорообразования в присутствии глюкозы и об­ разуют повышенное количество сериновой протеазы благодаря мутации в области catA. Что касается контроля трансляции, то существует три способа ее мо­ дифицировать:

а) увеличить стабильность мРНК;

б) повысить эффективность сайтов инициации трансляции;

в) повысить элонгацию цепи.

Мутации, изменяющие секрецию ферментов, особенно полезны для повышения выхода ферментов, хотя молекулярные механизмы этих про­ цессов редко расшифрованы. Такие мутации получают селекцией на устой­ чивость к различным антибиотикам, изменяющим структуру клеточной стенки. Например, по устойчивости к циклосерину, ампициллину, ново­ биоцину были получены продуценты у B. subtilis, секретирующие в 5 раз больше фермента, чем исходный штамм. Сходным образом были получе­ ны продуценты у Fusarium и Trichoderma.

Технологичность (способность штамма расти в производственных условиях и эффективно сбраживать моно-, ди- и трисахариды сусла с образованием большого количества этилового спирта)