34)Методы иммобилизации клеток микроорганизмов
Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ как перед иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками:
отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;
снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;
более высокая активность и стабильность;
возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов;
способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов.
Для иммобилизации могут быть использованы клетки в различном состоянии: живые и поврежденные в различной степени. Одностадийные реакции могут осуществлять и живые, и поврежденные клетки. Полиферментные реакции проводят с применением живых клеток, которые могут длительное время регенерировать АТФ и коферменты (НАДФ, НАД).
Проблема использования ферментативной активности иммобилизованных микроорганизмов имеет глубокие корни. Более 150 лет назад быстрый способ получения уксуса был основан на применении микроорганизмов, адсорбированных на древесной стружке. Методы иммобилизации клеток схожи с методами иммобилизации ферментов.
Химический метод основан на образовании ковалентных связей с активированным носителем, на поперечной сшивке клеток за счет активных групп в клеточной оболочке с бифункциональными реагентами (например, глутаровым альдегидом)
К физическим методам относятся адсорбция и агрегация.
Иммобилизация клеток путем включения в различные гели, мембраны, волокна основана на химических и физических взаимодействиях. Химические методы используются реже по сравнению с другими методами и малопригодны для иммобилизации живых клеток. Гораздо большее распространение получило включение клеток в состав гелей, мембран и волокон. При таком способе иммобилизации клетки могут сохранять жизнеспособность и в присутствии питательной среды размножаться в приповерхностных слоях гелей. Биокаталитическая активность целых иммобилизованных клеток в настоящее время может быть использована в различных отраслях науки и техники:
при биосинтезе и трансформации таких соединений, как аминокислоты, органические кислоты, антибиотики, стероиды углеводы, углеводороды, нуклеотиды и нуклеозиды;
в пивоварении и виноделии;
при очистке сточных и природных вод;
при извлечении металлов из сточных вод;
при ассимиляции солнечной энергии;
при изготовлении водородных солнечных элементов;
в азотфиксации;
в аналитических целях при изготовлении электродов.
35)особенности
живых иммобилизованных клеток
микроорганизмов. Преимущества
использования в промышленном производстве.
Живые иммобилизованные клетки
осуществляют как одностадийные , так и
многостадийные процессы , даже сложнейшие
процессы биосинтеза антибиотиков и
ферментов. В отличии от свободных клеток
они подвергаются специфическим
воздействиям уже на стадии иммобилизации.
Особое влияние оказывает процесс
полимеризации акриловых мономеров.
Жизнеспособность определяется либо по
количеству колоний , либо по количеству
клеток ,способных к делению в специальных
микрокамерах с питательной средой. В
отдельных случаях о жизнеспособности
судят по дыхательной активности или
по подвижности клеток. После иммобилизации
микроорганизмы распределяются в толще
геля равномерно . В дальнейшем образуется
активный приповерхностный слой .
Активность и стабильность иммобилизованных
систем определяются преимущественно
способом иммобилизации и природой
носителя, условиями иммобилизации и
возможностью инкубации в питательной
среде , возможностью сохранения клеток
в жизнеспособном состоянии . Именно
жизнеспособные клетки осуществляют в
иммобилизованном состоянии процессы
биосинтеза различных органических
соединений , в том числе органических
кислот , антибиотиков и ферментов. Живые
иммобилизованные клетки являются
активными и стабильно действующими
системами. При наличии подходящего
носителя ( с хорошими физическими и
механическими свойствами ) клетки
микроорганизмов могут нормально
размножаться внутри полимера и частично
в среде , окружающей носитель. Такая
система состоит из иммобилизованных
и свободных клеток. Иммобилизованные
клетки микроорганизмов – один из
перспективных типов биокатализаторов.
Они все шире применяются не только в
области синтеза ценных органических
соединений , но и при очистке сточных
вод и воздуха от загрязнения , для
извлечения из них ценных веществ .
Решение проблем биоэнергетики и
азотфиксации также связано с применением
иммобилизованных клеток. Поэтому
необходимы глубокие знания особенностей
взаимодействия носителей и клеток.
Одна из главнейших задач настоящего
времени – проблема длительного
поддержания клеток в жизнеспособном
состоянии. Не менее важна и интересна
проблема иммобилизации клеток,
сконструированных генной инженерией
, сохранение их в активности , жизнеспособном
состоянии после иммобилизации.
36)носители,
используемые для иммобилизации ферментов
и клеток Классификация
носителей для ферментов
Для
получения иммобилизованных ферментов
используется ограниченное число как
органических, так и неорганических
носителей. По Дж. Порату
(1974), идеальные материалы используемые
для иммобилизации ферментов, должны
обладать следующими
свойствами:
1.Нерастворимостью;
2.Высокой
химической и биологической
стойкостью;
3.Значительной
гидрофильностью;
4.
Достаточной проницаемостью как для
ферментов, так и для субстратов и
продуктов реакции;
5.Способностью
носителя легко активироваться.
В
зависимости от природы носители
делятся на:
В
свою очередь, каждый из классов
органических полимерных носителей
подразделяется на
группы в
зависимости от их строения.
Среди природных полимеров
выделяют: белковые; полисахаридные; липидные носители,
а
средисинтетических: полиметиленовые; полиамидные; полиэфирные носители.
К преимуществам природных
носителей следует отнести:
1. Доступность; 2. Полифункциональность; 3.
Гидрофильность, а
к недостаткам – высокую
стоимость.
Из полисахаридов для
иммобилизации наиболее часто
используют: целлюлозу,
декстран, агарозу и
их производные. Для
придания химической устойчивости их
линейные цепи поперечно сшивают
эпихлоргидрином. В
полученные сетчатые структуры легко
вводят различные ионогенные
группировки.
Из природных аминосахаридов в
качестве носителей для иммобилизации
применяют хитин, который
в значительных количествах накапливается
в виде отходов в процессе промышленной
переработки крабов
и креветок. Хитин
химически стоек и имеет хорошо выраженную
пористую структуру.
Среди белков практическое
применение в качестве носителей нашли
структурные протеины, такие как: кератин,
фиброин, коллаген и продукт переработки
коллагена –желатин. Эти
белки широко распространены в природе,
поэтому доступны в больших количествах,
дешёвы и имеют большое число функциональных
групп для связывания фермента. Белки
способны к биодеградации, что очень
важно при конструировании иммобилизованных
ферментов для биотехнологических
целей.
Синтетические
полимерные носители включают полимеры на
основе стирола,
акриловой кислоты, поливинилового
спирта, полиамидные и полиуретановые поли
меры. Их преимущество:
1. Механическая прочность;
2. Возможность варьирования в широких
пределах величины пор и введения
различных функциональных групп.
Синтетические полимеры воспроизведены
в таких изделиях, как трубы, волокна,
гранулы.
Носители
неорганической природы представляют
собой материалы изготовленные
из стекла, глины, керамики, графитовой
сажи, а также силохромы
и оксиды металлов. Их можно подвергать
химической модификации, для чего носители
покрывают плёнкой оксидов алюминия,
титана, циркония. Или обрабатывают
органическими полимерами.
В промышленных
процессах чаще используют покоящиеся
клетки. Для подавления роста иммобилизованных
клеток растений используют дефицит
фитогормонов, а рост клетки бактерий
тормозят добавлением антибиотиков.
Гораздо
большее распространение получило
включение клеток в состав гелей, мембран
и волокон. При таком способе иммобилизации
клетки могут сохранять жизнеспособность
и в присутствии питательной среды
размножаться в приповерхностных слоях
гелей. 37)Методы
иммобилизации ферментов и клеток
Иммобилизованные
клетки имеют ряд преимуществ как перед
иммобилизованными ферментами, так и
перед свободными клетками:
1)
отсутствие затрат на выделение и очистку
ферментов;
2) снижение затрат на
выделение и очистку продуктов реакции;
3)более высокая
активность и стабильность;
4)
возможность создания непрерывных и
полунепрерывных автоматизированных
процессов; 5)
способность к длительному функционированию
полиферментных систем без экзогенных
кофакторов.
Для
иммобилизации могут быть использованы
клетки в различном состоянии: живые и
поврежденные в различной степени.
Одностадийные реакции могут осуществлять
и живые, и поврежденные клетки.
Полиферментные реакции проводят с
применением живых клеток, которые могут
длительное время регенерировать АТФ и
коферменты (НАДФ, НАД). Методы иммобилизации
клеток схожи с методами иммобилизации
ферментов.
Химический метод основан
на образовании ковалентных связей с
активированным носителем, на поперечной
сшивке клеток за счет активных групп в
клеточной оболочке с бифункциональными
реагентами (глутаровым альдегидом).
К
физически методам относятся адсорбция
и агрегация. Иммобилизация клеток путем
включения в различные гели, мембраны,
волокна основана на химических и
физических взаимодействиях. Химические
методы используются реже по сравнению
с другими методами и малопригодны для
иммобилизации живых клеток. Большее
распространение получило включение
клеток в состав гелей, мембран и волокон.
так клетки могут сохранять жизнеспособность
и в присутствии питательной среды
размножаться в приповерхностных слоях
гелей. Биокаталитическая активность
целых иммобилизованных клеток в настоящее
время может быть использована в различных
отраслях науки и техники:
1) при биосинтезе и
трансформации таких соединений, как
аминокислоты, органические кислоты,
антибиотики, стероиды углеводы,
углеводороды, нуклеотиды и нуклеозиды;
2) в
пивоварении и виноделии;
3)
при очистке сточных и природных вод;
4)
при извлечении металлов из сточных вод;
5)
при ассимиляции солнечной энергии;
6)при изготовлении водородных солнечных
элементов; 7)
в азотфиксации;
8)
в аналитических целях при изготовлении
электродов.
Ферменты и
ферментные системы широко используются
в различных отраслях промышленности,
медицине, с/х, хим. анализе и т.д. Ферменты
- вещества белковой природы и поэтому
неустойчивы при хранении и чувствительны
к тепловым воздействиям. Они
не могут быть использованы многократно
из-за трудностей в отделении их от
реагентов и продуктов реакции. Решить
эти проблемы помогает создание
иммобилизованных ферментов. Начало
этому методу было положено в 1916 году,
когда Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали
на угле инвертазу и показали, что она
сохраняет в таком виде каталитическую
активность. Сам термин "иммобилизованные
ферменты узаконен в 1971 году, и означает
любое ограничение свободы передвижения
белковых молекул в пространстве. Сущность
иммобилизации ферментов —
прикрепление их в активной форме к
нерастворимой основе или заключение в
полупроницаемую мембранную систему.
Прикрепление фермента к носителю
осуществляется адсорбционно-химической
связью или путем механического включения
фермента в органический или неорганический
гель (в капсулу и т. п.). Носитель фермента
может быть как природное вещество, так
и синтетический полимер. Плюсы иммобил-х
ферментов перед нативными предшественниками:
1)
Гетерогенный катализатор легко отделим
от реакционной среды, что дает возможность
остановить реакцию в любой момент,
использовать фермент повторно, а также
получать чистый от фермента продукт.
2) Ферментативный
процесс с использованием иммобилизованных
ферментов можно проводить непрерывно,
регулируя скорость катализируемой
реакции и выход продукта.
3) Модификация
фермента целенаправленно изменяет его
свойства, такие как специфичность
(особенно в отношении макромолекулярного
субстрата), зависимость каталитической
активности от рН, ионного состава и
других параметров среды, стабильность
к денатурирующим воздействиям.
4) Можно регулировать
каталитическую активность иммобилизованных
ферментов путем изменения свойств
носителя действием физических факторов,
таких как свет и звук. Иммобилизовать
ферменты можно как путем связывания на
нерастворимых носителях, так и путем
внутримолекулярной или межмолекулярной
сшивки белковых молекул низкомолекулярными
бифункциональными соединениями, а также
путем присоединения к растворимому
полимеру. 38)иммобилизованные
клетки. использование в синтезе
биологически активных веществ и системах
биологической очистки. Преимущество
по сравнению с иммобилизованными
ферментами. В
70-х годах XX века появились первые
публикации об иммобилизации клеток
микроорганизмов, а первое промышленное
применение иммобилизованных клеток
было осуществлено в Японии в 1974 г. С их
помощью получали аспарагиновую кислоту.
Иммобилизованные
клетки имеют ряд преимуществ как перед
иммобилизованными ферментами, так и
перед свободными клетками:
отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;
снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;
более высокая активность и стабильность;
возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов;
способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов.
Для иммобилизации могут быть использованы клетки в различном состоянии: живые и поврежденные в различной степени. Одностадийные реакции могут осуществлять и живые, и поврежденные клетки. Полиферментные реакции проводят с применением живых клеток, которые могут длительное время регенерировать АТФ и коферменты (НАДФ, НАД).
Проблема использования ферментативной активности иммобилизованных микроорганизмов имеет глубокие корни. Более 150 лет назад быстрый способ получения уксуса был основан на применении микроорганизмов, адсорбированных на древесной стружке. Методы иммобилизации клеток схожи с методами иммобилизации ферментов.
Химический метод основан на образовании ковалентных связей с активированным носителем, на поперечной сшивке клеток за счет активных групп в клеточной оболочке с бифункциональными реагентами (например, глутаровым альдегидом)
К физическим методам относятся адсорбция и агрегация.
Иммобилизация клеток путем включения в различные гели, мембраны, волокна основана на химических и физических взаимодействиях. Химические методы используются реже по сравнению с другими методами и малопригодны для иммобилизации живых клеток. Гораздо большее распространение получило включение клеток в состав гелей, мембран и волокон. При таком способе иммобилизации клетки могут сохранять жизнеспособность и в присутствии питательной среды размножаться в приповерхностных слоях гелей. Биокаталитическая активность целых иммобилизованных клеток в настоящее время может быть использована в различных отраслях науки и техники:
при биосинтезе и трансформации таких соединений, как аминокислоты, органические кислоты, антибиотики, стероиды углеводы, углеводороды, нуклеотиды и нуклеозиды;
в пивоварении и виноделии;
при очистке сточных и природных вод;
при извлечении металлов из сточных вод;
при ассимиляции солнечной энергии;
при изготовлении водородных солнечных элементов;
в азотфиксации;
в аналитических целях при изготовлении электродов.
Самыми способными к борьбе с загрязнителями различного типа являются представители рода Pseudomonas – они практически «всеядны». Клетки этих микроорганизмов содержат оксидоредуктазы и гидроксилазы, способные разлагать большое число молекул углеводородов и ароматических соединений, таких как бензол, ксилол, толуол. Гены, кодирующие эти ферменты, находятся в составе плазмид. Например, плазмида OCT отвечает за разложение октана и гексана, XYL – ксилола и толуола, NAH – нафталина, CAM – камфары. Плазмиды САМ и NAH обеспечивают собственный перенос, индуцируя скрещивание бактериальных клеток; остальные плазмиды могут быть перенесены только в том случае, если в бактерии введены другие плазмиды, обеспечивающие скрещивание.
В 1979 г. Чакрабарти (в то время совместно с компанией «Дженерал электрик») после успешных скрещиваний получил штамм, содержащий плазмиды XYL и NAH, а также гибридную плазмиду, полученную путем рекомбинации частей плазмид САМ и ОСТ (сами по себе они несовместимы, т. е. не могут сосуществовать как отдельные плазмиды в одной бактериальной клетке). Этот штамм способен быстро расти на неочищенной нефти, так как он метаболизирует углеводороды гораздо активнее, чем любой из штаммов, содержащих только одну плазмиду. Штамм может быть особенно полезен в очистных водоемах для сточных вод, где можно контролировать температуру и другие внешние факторы.
Эти микроорганизмы удобно использовать для очистки нефтяных пятен на суше или море при различных авариях. Для большей эффективности создают микроэмульсию, содержащую бактериальные штаммы и капсулы со смесью основных питательных элементов - азота, фосфора и калия внутри. Добавление этих веществ стимулирует размножение бактриальных штаммов. Применение такого метода позволяет очистить от 70 до 90% загрязненной поверхности, за это же время очищается всего порядка 10-20% необработанной поверхности.
Преимущество бактериальной очистки по сравнению с химической в том, что она не вызывает появления нового загрязняющего агента в окружающей среде. Плотность фитопланктона после бактериальной очистки повышается. Некоторые микроорганизмы способны изменять молекулу ксенобиотика и делать ее доступной и привлекательной для других микроорганизмов («кометаболизм»). Примером может служить разложение инсектицида паратиона под действием двух штаммов Pseudomonas – P. aeruginosa и P. stuzeri. В некоторых случаях происходит неполное превращение молекулы ксенобиотика - фосфорилирование, метилирование, ацетилирование и т. д., результатом которого является утрата этим веществом токсичности.
Одним из сильных загрязнителей является ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). Причина в том, что ЭДТА связывает тяжелые металлы, способствуя их накоплению в почве. Бактрии родов Pseudomonas и Bacillus способны за две недели разрушить все связи комплекса Fe-ЭДТА. Эти бактерии успешно применяются для очистки бытовых сточных вод, куда попадают детергенты моющих средств. Кроме Pseudomonas, биодеградацию ксенобиотиков могут осуществлять и представители родов Acinetobacter, Metviosinus.
Однако, в некоторых случаях внесение этих микроорганизмов в почву может изменить экосистему местности. Избежать этого можно ограничивая время жизнедеятельности бактерий. Например, облучая штаммы ультрафиолетом, получили мутант, ауксотрофный по лейцину. Бактерии размножают в питательной среде, содержащей лейцин. Суспензией микроорганизмов в питательной среде пропитывают древесную стружку, которую разбрасывают по загрязненной территории. Количество лейцина рассчитывается на время, достаточное для уничтожения вредных примесей, поэтому после очистки мутантные штаммы гибнут.
Еще эффективнее, чем бактерии, справляются с посвенными загрязнителями грибы. Они могут разрушать такие вещества, как пентахлорбензол, пентахлофенол. В одном из экспериментов грибами обработали около 10000 тонн почвы с территории деревоперерабатывающего комплекса. В этой почве содержание пентахлорфенола достигало 700 мг/кг, но за год деятельности оно снизилось до 10 мг/кг, что является допустимой нормой. Бактерии смогли бы переработать эту почву лишь за 4-5 лет. Грибы активны и зимой, разрушают высокомолекулярные полиароматические углеводороды, действуют внеклеточно, выделяя неспецифические ферменты. Стоимость грибной и бактериальной очистки одинаковы, но применение грибов позволяет сокращать сроки деградации и существенно удешевляет ее.