Глава 2. Исследование микроэлементов

2.1. Гематологические методы исследования

Исследования проводились унифицированными методами, утверждёнными Министерством здравоохранения РФ, с использованием наборов фирмы «Агат» утверждённых Приказом Росздравнадзора.

Набор предназначен для количественного колориметрического определения содержания железа в сыворотке крови человека по реакции с динатриевой солью 3-(2-пиридил)-5,6-бис(4-сульфофенил)-1,2,4-триазина (феррозином) без депротеинизации в клинико-диагностических и биохимических лабораториях. 

Принцип метода: Железо освобождается из железосвязывающих белков сыворотки крови и восстанавливается под действием кислого рабочего раствора, содержащего восстановитель (гидроксиламин) и детергент. Затем, после добавления буфера для создания в реакционной смеси необходимого рН (4,5–4,8) и феррозина, образуется устойчивый окрашенный железо-феррозиновый комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации железа в анализируемом образце и измеряется фотометрически при 562 (560–580) нм. Для исключения влияния меди, содержащейся в сыворотке, в рабочий раствор включена тиомочевина.

Состав набора: 1. Рабочий раствор без гидроксиламина, 100 мл – 1 флакон;

2. Гидроксиламин, 4,0 г – 1 флакон;

3. Буфер (натрия ацетат), 25 мл – 1 флакон;

4. Раствор феррозина, (30 г/л), 0,8 мл – 1 флакон;

5. Калибровочный раствор железа (89,5 мкмоль/л), 5 мл – 1 флакон.

Аналитические характеристики набора: Линейная область определения концентрации железа – в диапазоне от 3,58 до 89,5 мкмоль/л, отклонение от линейности – не более 5%.

Чувствительность определения – не более 1,8 мкмоль/л.

Воспроизводимость: коэффициент вариации не более 5%.

Качество набора можно оценивать по контрольным сывороткам отечественного или зарубежного производства, аттестованным данным методом. Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон нормальных величин у обследуемого контингента.

Оборудование и реагенты:

– Спектрофотометр, длина волны 562 нм, или фотоэлектроколориметр, длина волны 560–580 нм, кювета с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм;

– пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,02; 0,5 и 2,5 мл;

– пробирки пластмассовые одноразовые нестерильные вместимостью 5–10 мл;

– секундомер;

– вода дистиллированная;

– перчатки резиновые или пластиковые.

Анализируемые образцы: Сыворотка крови.

 Подготовка реагентов для анализа:

Рабочий раствор. Содержимое флакона с гидроксиламином растворить при перемешивании в рабочем растворе.

Рабочий раствор можно хранить в плотно укупоренном виде при температуре +2–8° С не более 3-х месяцев.

Остальные реактивы готовы к использованию.

Проведение анализа: Компоненты реакционной смеси внести в пробирки в количествах, указанных в таблице 1:

При измерении оптической плотности использовать кюветы с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. Окраска устойчива в течение 1 часа после окончания инкубации.

Таблица 1. Ход определения.

Отмерить, мл	Опытная проба	Калибровочная проба	Контрольная (холостая) проба
Сыворотка крови	0,50	-	-
Калибровочный раствор железа	-	0,50	-
Рабочий раствор	2,50	2,50	2,50
Содержимое пробирок тщательно перемешать и инкубировать в течении 30 минут при комнатной температуре (+18-25С)
Буфер	0,50	0,50	1,00
Содержимое пробирок тщательно перемешать и измерить оптическую плотность опытной пробы (E1) при 562 нм против воды
	E1
Раствор феррозина	0,02	0,02	0,02
Содержимое пробирок тщательно перемешать, инкубировать в течении 5 минут при комнатной температура и измерить оптическую плотность опытной пробы (E2) и калибровочной пробы (Eк) при 562 нм против холостой пробы
	E2	Eк

Расчеты:

Концентрацию железа рассчитать по формуле:

E2 – E1

С = --------------- х  89,5 ,

    Eк

где: С  – концентрация железа в опытной пробе, мкмоль/л;

E2 и E1 – оптические плотности опытной пробы до и после добавления феррозина, соотоветственно, ед.опт.плотн.;

Eк – оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;

89,5  – концентрация железа в калибровочной пробе, мкмоль/л.

 Примечание: при использовании кювет другого объема расход реагентов может быть пропорционально изменен.

Диагностическая информация:

При повышении концентрации железа в крови: пернициозная, апластическая и гемолитическая анемии; гемохроматоз, острая лейкемия, отравление свинцом, острый гепатит, і дефицит витамина В, талассемия, избыточное лечение железом, повторные переливания крови, острое отравление железом, нефрит.

При снижении концентрации железа в крови: железодефицитная анемия, ремиссия пернициозной анемии, острые и хронические инфекции, рак, нефроз, гипотиреоидизм, состояние после оперативного вмешательства.

Референтные пределы:

- Новорожденные - 17,8-44,8 мкмоль/л; - Младенцы -  7,2-17,9 мкмоль/л;

- Дети -  9,0-21,5 мкмоль/л;

- Взрослые: мужчины - 11,6-31,3 мкмоль/л;