4. Практические навыки. Принцип обнаружения капсул у бактерий, укажите известную методику. Что такое капсулы, для чего изучаются?

Капсула - слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов (пневмококк) или полипептидов (бацилла сибирской язвы). Микрокапсулу (толщиной менее 0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий, четко выраженную макрокапсулу (толщиной более 0,2 мкм) формируют пневмококк, клебсиеллы, возбудитель сибирской язвы и некоторые другие. У патогенных бактерий капсула образуется в макроорганизме, на искусственных питательных средах она обычно утрачивается (за исключением клебсиелл).

В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от бактериофага, фагоцитоза и гуморальных факторов иммунитета, определяет антигенную специфичность микроорганизмов.

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления чаще всего применяют методы негативного контрастирования.

Метод выявления капсулы по Бурри-Гинсу:

1. На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с помощью петли с каплей культуры капсульных бактерий.

2. Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки.

3. Окрашивают 5 мин карболовым фуксином, разведенным водой 1:3.

4. Осторожно промывают водой, высушивают. Окраска по Романовскому-Гимзе. Фиксированный мазок кладут в чашку Петри мазком вниз на подставки из стеклянной соломки или спичек и наливают рабочий раствор краски Романовского-Гимза (15—20 капель на 10 мл воды). Через 15—20 мин препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Бактерии окрашиваются в тёмно-синий цвет, капсулы — в розовый.

Окраска по Михину. На фиксированный мазок наливают метиленовую синь Леффлера (30 мл насыщенного спиртового раствора метиленовой сини растворяют в 100 мл воды, добавляют 1 мл 1% раствора NaOH и выдерживают в термостате месяц) при лёгком нагревании выдерживают 3—5 мин., быстро промывают водой и высушивают. Бактерии окрашиваются в синий цвет, капсулы — в розовый.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.

№2

5. Бактерии: основные биологические свойства и методы их изучения. Принципы современной систематики бактерий.

Бакте́рии (эубактерии (лат. Eubacteria), др.-греч. βακτήριον — палочка) — домен живых организмов (по трёхдоменной системе Карла Вёзе наряду с археями и эукариотами). Бактерии и археи относятся к прокариотным (безъядерным) микроорганизмам, чаще всего одноклеточным. К настоящему времени описано около десяти тысяч видов бактерий и предполагается, что их существует свыше миллиона.

Строение.

Подавляющее большинство бактерий (за исключением актиномицетов и нитчатых цианобактерий) одноклеточны. По форме клеток они могут быть округлыми (кокки), палочковидными (бациллы, клостридии, псевдомонады), извитыми (вибрионы, спириллы, спирохеты), реже — звёздчатыми, тетраэдрическими, кубическими, C- или O-образными. Формой определяются такие способности бактерий, как прикрепление к поверхности, подвижность, поглощение питательных веществ. Отмечено, например, что олиготрофы, то есть бактерии, живущие при низком содержании питательных веществ в среде, стремятся увеличить отношение поверхности к объёму, например, с помощью образования выростов (т. н. простек).

Из обязательных клеточных структур выделяют три:

1. нуклеоид,

2. рибосомы,

3. цитоплазматическая мембрана (ЦПМ).

С внешней стороны от ЦПМ находятся несколько слоёв (клеточная стенка, капсула, слизистый чехол), называемых клеточной оболочкой, а также поверхностные структуры (жгутики, ворсинки). ЦПМ и цитоплазму объединяют вместе в понятие протопласт.

Для видовой идентификации бактерий нужно знать следующие их свойства:

· морфологические (форма, строение клетки);

· культуральные (способ питания, условия размножения, т. е факторы роста бактериальной культуры);

· тинкториальные (реакция на красители, помогающая определить степень опасности для здоровья);

· биохимические (расщепление питательных веществ, выделение продуктов жизнедеятельности, синтез ферментов, белков, витаминов);

· антигенные (от англ. antibody-generator – «производитель антител»), вызывающие иммунную реакцию организма.

Морфологические свойства определяют с помощью микроскопии (рассматривая в обычный или электронный микроскоп). Культуральные (биологические) свойства проявляются во время роста культур на питательных средах. Идентификация по биохимическим свойствам нужна для определения отношения клетки к кислороду (способ дыхания), ее ферментативных и редуцирующих (восстановительных) свойств (редукция – химический процесс отнятия кислорода или замена его на водород). Кроме того, биохимические исследования изучают образование отходов жизнедеятельности бактерий (токсинов) и их влияние на окружающую среду.

Анализ всех этих свойств в совокупности помогает определить вид бактериальной клетки. Такая идентификация дает возможность отличать «хорошие» бактерии, приносящие пользу, от вредных болезнетворных микробов с отрицательными свойствами. Строго говоря, это разделение достаточно условно. Один и тот же вид бактерий может оказывать положительное или отрицательное действие в зависимости от ситуации. Например, кишечная палочка является частью микрофлоры здорового человека и принимает активное участие в пищеварении. Но стоит популяции этих бактерий разрастись выше граничных параметров – возникает опасность отравления токсинами, опасными для здоровья.

Систематика (= таксономия) бактерий является одним из наиболее важных и сложных, но менее разработанных разделов микробиологии.

· Задачами систематики являются классификация, номенклатура и идентификация организмов.

· Классификация – распределение множества организмов по группам (таксонам).

· В настоящее время в микробиологии приняты два различных подхода к систематике, обусловливающих наличие двух систем классификации: филогенетической (естественной) и фенотипической (искусственной).

· В основу филогенетической классификации положена идея создания системы прокариот, объективно отражающей родственные отношения между разными группами бактерий и историю их эволюционного развития.

· Фенотипическая классификация преследует, в первую очередь, практические цели, которые заключаются в том, чтобы быстрее установить принадлежность микроорганизма к определенному таксону. Общепринятой схемы классификации бактерий не существует, но наиболее популярной и широко применяемой является схема, приведенная в «Определителе бактерий Берджи». Первое издание его вышло в 1923 году, последнее (9–е) – в 1994 году. Описание бактерий приводится по группам (35 групп), в состав которых включены семейства, роды и виды.

· Номенклатура – присвоение названий отдельным группам и видам микроорганизмов. В систематике бактерий, так же как и в ботанике, зоологии, принята бинарная номенклатура, согласно которой бактериям присваивается название, состоящее из двух слов: первое определяет их принадлежность к конкретному роду, второе – к виду. Например, Clostridium botulinum иClostridium tetani – два различных вида бактерий, которые относятся к одному роду. Названия бактериям присваивают в соответствии с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий.

· Вид – это основная таксономическая категория. В микробиологии под видом обычно понимают типовой штамм и все остальные штаммы, которые считаются достаточно сходными с типовым штаммом.

· Типовой штамм– это штамм, выбранный в качестве постоянного образца того, что подразумевается под данным видом. Культуры типовых штаммов находятся в различных коллекциях (например, американская коллекция типовых культур).

· Виды объединяются в роды, роды – в семейства, семейства – в порядки, далее следуют классы, отделы, царства. В микробиологии существуют также более мелкие таксономические единицы, чем вид: подвид (subspeciens), разновидность. Подвиды могут различаться по физиологическим (biovar), морфологическим (morphovar) или по антигенным (serovar) свойствам.

· Клон – чистая культура, полученная из одной клетки

· Штамм – культуры бактерий одного вида, выделенные из различных источников либо из одного источника в разное время либо полученные в ходе генетических манипуляций. Разные штаммы одного и того же вида бактерий могут отличаться друг от друга по целому ряду свойств, например, по чувствительности к антибиотикам, способности к синтезу токсинов, ферментов и др.

· Идентификация - устанавливает принадлежность микроорганизмов к определенному таксону на основании наличия конкретных признаков. В большинстве случаев идентификация заключается в определении родовой и видовой принадлежности микроорганизмов.

· При идентификации микроорганизмов следует придерживаться определенных правил:

- быть уверенным в чистоте выделенной культуры;

- постановку тестов по изучению физиолого-биохимических особенностей проводить не менее, чем в двукратной повторности;

- обязательной является постановка заведомо положительного и заведомо отрицательного контроля.

· Исследователь должен выяснить, является ли организм фототрофным, хемоавтотрофным или хемогетеротрофным. Необходимо также знать, является ли он аэробом, анаэробом, микроаэрофилом или факультативным анаэробом, а также определить некоторые морфологические свойства, окраску по Граму, форму клеток, специфические морфологические признаки (наличие спор, капсул и т. д.). Весьма важными являются три физиологических теста: на наличие каталазы, наличие оксидазы и способности к аэробному или анаэробному катаболизму углеводов.

· При классификации бактерий учитывается большое количество различных свойств и признаков.

· Критериями систематики являются свойства и признаки, характерные для всех бактерий данной группы и нехарактерные для микроорганизмов других групп. Чем больше общих признаков имеют сравниваемые организмы, тем больше и оснований для включения их в одну таксономическую группу.