Лабораторне заняття №4 Організація геномів прокаріотів та еукаріотів
Питання для підготовки з теоретичного матеріалу:
Організація геномів
Генетичний код
Гени
Геноми
Молекулярна організація хроматину
Нуклеосома
Посттрансляційні модифікації гістонових хвостів
Гістон Н1
Наднуклеосомна упаковка хроматинової фібрили
Петльові домени хроматину та ядерний матрикс
Основні терміни:
Геном – сукупність послідовностей ДНК. Під геномом виду розуміють сукупність послідовностей ДНК в гаплоїдному хромосомному наборі.
Ген – ділянка ДНК, яка необхідна та достатня для синтезу функціонального РНК-продукту.
Оперон – декілька генів, об'єднаних у єдину транскрипційну одиницю. Найчастіше це гени, які кодують пов'язані між собою функціонально білки (наприклад, такі, що приймають участь у біосинтезі амінокислот або в метаболізмі поживних речовин).
Мобільні генетичні елементи – ділянки ДНК, які здатні змінювати своє положення та/або кількість копій у геномі.
Плазміда – невелика кільцева дволанцюгова позахромосомна молекула ДНК.
Екзон – кодуюча ділянка еукаріотичного гена.
Інтрон – некодуюча ділянка еукаріотичного гена.
Псевдогени – нефункціональні копії генів.
Паліндромна послідовність ДНК – послідовність нуклеотидів, яка є ідентичною на обох комплементарних ланцюгах при зчитуванні її у напрямку 5'→3'. Паліндромні послідовності є самокомплементарними (наприклад, ТGGАТССА).
Родина генів – група генів, що мають ідентичні або подібні послідовності.
Генний кластер – група генів, що відносяться до однієї родини та знаходяться в одній хромосомі поряд один з одним.
Хроматин – комплекс білків та ДНК, що знаходиться в ядрі.
Гістони – основні білки хроматину, відносно невеликі за молекулярною вагою та збагачені на позитивно заряджені амінокислоти.
Нуклеосома – елементарна структурна одиниця хроматину, що складається з октамеру білків-гістонів та ДНК, що намотується на октамер.
Еухроматин – транскрипційно активний хроматин.
Гетерохроматин – частина хроматину, що зберігає високий ступінь компактизації в інтерфазі.
Центромера – ділянка хромосомної ДНК та зв'язані з нею білки, що забезпечують збірку мультибілкового комплексу – кінетохору, до якого приєднуються мікротрубочки веретена поділу.
Теломера – кінцева ділянка хромосоми.
Задача 1
Сайт рестрикції для рестриктази BamHІ G↓GATC↑C, рестриктази Sau3A – N↓GATC↑N (стрілки вказують місця рестрикції, послідовності нуклеотидів наведені у напрямку 5' → 3', N – будь-який нуклеотид). Яка частка сайтів BamHІ розщеплюється також Sau3A.
Розв'язок
Рестриктази – це ферменти, які здатні руйнувати фосфодіефірні зв'язки у молекулі ДНК у чітко визначених послідовностях (сайтах рестрикції). Сайти рестрикції двох даних в умові рестриктаз містять ідентичну чотиринуклеотидну послідовність – GАТС, але нуклеотиди, які її фланкують, можуть бути будь-якими для рестриктази Sau3A. Відповідно, дана рестриктаза розщепить всі сайти (100%) BamHІ, оскільки для неї не мають значення нуклеотиди, що розміщенні по боках послідовності GАТС. На відміну від Sau3A, сайт рестрикції ВатНІ повинен обов'язково містити з 5'-кінця послідовності GАТС, спільної для двох рестриктаз, гуаніловий нуклеотид, а з 3'-кінця – цитидиловий. Імовірність того, що з 5'-кінця послідовності GАТС буде розміщений саме G, дорівнює 1/4 (один з чотирьох можливих нуклеотидів). Аналогічна імовірність розміщення С з 3'-кінця. Отже, загальна імовірність появи сайту рестрикції для ВатНІ серед сайтів Sau3A рівна 1/4*1/4 = 1/16. Таким чином, 1/16 частка сайтів рестрикції Sau3A буде розщеплена рестриктазою ВатНІ.
Задача 2
Фрагмент ДНК розміром 5 кЬ (тисяч пар основ) має сайти рестрикції двох рестриктаз – ВатНІ та ЕсоRI. На рисунку наведено результати електрофорезу (електрофореграма) цього фрагменту, обробленого (+) чи не обробленого (-) даними рестриктазами. На основі електрофореграми (див. рисунок) визначте, скільки сайтів рестрикції ВатНІ та ЕсоRI має даний фрагмент та побудуйте рестриктну карту.
Розв'язок
Для розв'язку цієї задачі в першу чергу слід зрозуміти, що таке метод електрофорезу (гель-електрофорезу). Електрофорез – один з найбільш вживаних методів молекулярної біології, який використовується для розділення молекул за їх молекулярною вагою. Молекули (в даному випадку – ДНК) наносять у спеціально приготовану пластинку гелю – застиглий розчин агарози. При полімеризації ця речовина утворює просторову сітку з комірками, розмір яких залежить від концентрації агарози. При пропусканні через гель електричного струму, негативно заряджена ДНК рухається в напрямку до аноду, долаючи опір агарози і ніби «протискаючись» у комірки гелю. Чим менша молекулярна вага фрагменту ДНК, тим швидше за певний час він подолає певну відстань. Таким чином, в залежності від розміру фрагменти ДНК розділяються на смуги: великі залишаються неподалік від місця нанесення зразка (старту), менші – віддаляються від нього по мірі зменшення їх розміру. Для візуалізації смуг використовують різні барвники (найчастіше – флуоресцентний барвник бромистий етидій).
Як показано на електрофореграмі, довжина необробленого фрагмента ДНК становить 5 тис. пар нуклеотидів (перша доріжка). При обробці цього фрагменту рестриктазою ЕсоRІ утворюються два фрагменти, розміром 4,5 та 0,5 тис. пар нуклеотидів (друга доріжка). Якщо ці два фрагменти у сумі дають довжину вихідного необробленого рестриктазою фрагмента, то в межах послідовності є один сайт рестрикції для ЕсоRІ. Аналогічно, один сайт рестрикції має і рестриктаза ВатНІ (третя доріжка, фрагменти 3 тис. та 2 тис. пар нуклеотидів). Тепер, для побудови рестриктної карти (схеми розміщення сайтів рестрикції на певній послідовності ДНК) необхідно сумістити сайти двох рестриктаз (вказані стрілками) таким чином, щоб при їх одночасній обробці вихідного фрагмента утворилися фрагменти 0,5 тис, 2 тис. та 2,5 тис. пар нуклеотидів.
Задача 3
Маса геному бактерії E. coli 3,174 × 109 атомних одиниць маси (а.о.м.), середня довжина кодуючої ділянки гена приблизно 1 000 пар нуклеотидів. Визначте кількість генів в геномі E. coli, враховуючи, що на кодуючі послідовності припадає 90% від усіх послідовностей геному, а маса одного нуклеотиду – 330 пар а.о.м.
Розв'язок
Спочатку розрахуємо масу кодуючої ділянки одного гена. Для цього помножимо кількість нуклеотидів кодуючої ділянки гена на масу одного нуклеотиду (враховуємо, що ДНК є дволанцюговою молекулою): 1000×2×330 = 6,6×105 а.о.м. Тепер розрахуємо масу всіх кодуючих послідовностей геному: 3,174×109×0,9 = 2,857×109 а.о.м. Розділивши отримане число на середню масу одного гена, отримаємо кількість генів в геномі Е. соlі: 2,857×109/6,6×105 = 4 329 генів.
Задачі для самостійного розв’язку
1. Сайт рестрикції для рестриктази 1 С↓GТТС↑С, рестриктази 2 – N↓GТТС↑N (стрілки вказують місця рестрикції, послідовності нуклеотидів наведені у напрямку 5'→3', N – будь-який нуклеотид).
Яка частка сайтів рестриктази 1 розщеплюється також рестриктазою 2? Яка частота зустрічності в геномі сайтів рестрикції рестриктази 1?
2. Сайт рестрикції для рестриктази 1 N↓GТАС↑С, рестриктази 2 – N↓GТАС↑N (стрілки вказують місця рестрикції, послідовності нуклеотидів наведені у напрямку 5'→3', N – будь-який нуклеотид).
Яка частка сайтів рестриктази 2 розщеплюється також рестриктазою 1? Яка частота зустрічності в геномі сайтів рестрикції рестриктази 1?
3. Сайт рестрикції для рестриктази 1 N↓GТАС↑N, рестриктази 2 – N↓GТАС↑N (стрілки вказують місця рестрикції, послідовності нуклеотидів наведені у напрямку 5'→3', N – будь-який нуклеотид).
Яка частка сайтів рестриктази 2 розщеплюється також рестриктазою 1? Яка частота зустрічності в геномі сайтів рестрикції рестриктази 2?
4. Сайт упізнання рестриктази АvаІ має послідовність СYСGRG, де Y – позначає будь-який піримідин, а R – пурин. Чому дорівнює очікувана відстань в парах нуклеотидів між сайтами рестрикції АvаІ будь-якої випадкової довгої послідовності ДНК.
5. Дві молекули ДНК, ідентичні за нуклеотидною послідовністю, обробляли рестриктазою ЕсоRІ. Продукти рестрикції наведені на електрофореграмі. Чим відрізняються вихідні молекули ДНК?
6. Фрагмент ДНК розміром 5 кb (тисяч пар основ) має сайти рестрикції двох рестриктаз – ВатНІ та ЕсоRІ. На рисунку наведено результати електрофорезу (електрофореграма) цього фрагменту, обробленого (+) чи не обробленого (-) даними рестриктазами. На основі електрофореграми (див. рисунок) визначте, скільки сайтів рестрикції ВатНІ та ЕсоRІ має даний фрагмент та побудуйте рестриктну карту.
7. Фрагмент ДНК розміром 8 кb (тисяч пар основ) має сайти рестрикції двох рестриктаз – рестриктази 1 (R1) та рестриктази 2 (R2). На рисунку наведено результати електрофорезу (електрофореграма) цього фрагменту, обробленого (+) чи не обробленого (-) даними рестриктазами. На основі електрофореграми (див. рисунок) визначте, скільки сайтів рестрикції R1 та R2 має даний фрагмент та побудуйте рестриктну карту.
8. Загальна довжина еукаріотичного гена становить 350 000 пар нуклеотидів. Визначте кількість нуклеотидів кодуючої частини гена, якщо інтрони складають 45%, а регуляторні елементи – 15% від загальної послідовності нуклеотидів.
9. Маса бактеріального геному 2,800×109 атомних одиниць маси (а.о.м.), середня маса кодуючої частини одного гена – 7×105 а.о.м (на кодуючи частини припадає 95% геному). Визначте середню кількість нуклеотидів регуляторної ділянки гена, враховуючи, що кожен ген містить одну регуляторну ділянку, а маса одного нуклеотиду – 330 а.о.м.
10. Геном ретровірусу представлений двома молекулами РНК, кожна молекула РНК містить три гени: ген gag складається з 2000 нуклеотидів, ген роl – з 2900 нуклеотидів та ген епv – з 1800 нуклеотидів. На позагенні послідовності РНК припадає 15% геному. Визначте масу кожного гена окремо та масу генома ретровірусу.