Лабораторне заняття №5 транскрипція та дозрівання рнк

Питання для підготовки з теоретичного матеріалу:

1. РНК-полімераза

   1. Загальний сценарій транскрипції в бактерій

   2. Структура РНК-полімерази

2. Ініціація транскрипції

3. Елонгація транскрипції

4. Термінація транскрипції

5. Регуляція транскрипції

   1. Лактозний оперон

   2. Антитермінація

   3. Атенюація

   4. Регуляція транскрипції бактеріофага λ

   5. Неспецифічна регуляція загального рівня транскрипції

6. РНК-полімераза II

   1. Структура РНК-полімерази ІІ

   2. Промотор РНК-полімерази ІІ

   3. Базальні фактори транскрипції

   4. Ініціація транскрипції РНК-полімеразою ІІ

7. РНК-полімерази І і ІІІ

   1. Ініціація транскрипції генів рибосомної РНК

   2. Ініціація транскрипції РНК-полімеразою ІІІ

8. Механізми активації транскрипції

   1. Транскрипційні фактори

   2. Зовнішня регуляція активності транскрипційних факторів

   3. Ацетилювання гістонів

   4. Доступність промоторів

   5. Комплекси ремоделювання хроматину

   6. Роль білків HMG в активації транскрипції

9. Елонгація РНК-полімерази через хроматин

10. Конститутивна репресія транскрипції: гетерохроматин

    1. Деацетилювання гістонів

    2. НР1-залежна система репресії

    3. Метилювання ДНК

    4. РНК-інтерференція

11. Кепування

12. Сплайсинг. Сплайсосома: механізм сплайсингу

13. Поліаденілування мРНК і термінація транскрипції

14. Альтернативний сплайсинг

15. Транс-сплайсинг

16. Редагування мРНК

Основні терміни:

Транскрипція – процес синтезу молекул РНК на матриці ДНК.

ДНК-залежна РНК-полімераза (РНК-полімераза) – фермент, який здатний синтезувати молекулу РНК із рибонуклеозидтрифосфатів з використанням молекули ДНК в якості матриці.

Промотор – місце зв'язування РНК-полімерази з ДНК, одна із регуляторних ділянок.

Матричний ланцюг ДНК – ланцюг ДНК, який РНК-полімераза обирає в якості матриці для синтезу РНК.

Кодуючий ланцюг ДНК – ланцюг ДНК, ідентичний за послідовністю до синтезованої РНК (є комплементарним до матричного ланцюга ДНК).

Термінатор – послідовність ДНК, що слугує сигналом для закінчення транскрипції.

Енхансер – дистальний регуляторний елемент, який сприяє підсиленню ефективності ініціації транскрипції.

Сайленсер – дистальний регуляторний елемент, який сприяє зниженню ефективності ініціації транскрипції.

Транскрипційні фактори – білки, які здатні регулювати транскрипцію.

Процесинг – процес дозрівання новосинтезованих молекул РНК з утворенням функціонального продукту.

Кепування – модифікація 5'-кінця молекули мРНК, яка полягає у приєднанні 7-метилгуаніну (кепу).

Сплайсинг – процес вирізання інтронів та зшивання екзонів.

Поліаденілування – модифікація 3'-кінця молекули мРНК, яка полягає у приєднанні 100-150 аденілових нуклеотидів.

Сплайсосома – рибонуклеопротеїдний комплекс, який забезпечує процес сплайсингу.

Редагування РНК – процес зміни, видалення або вставки окремих нуклеотидів в синтезованій молекулі пре-мРНК

Задача 1

Фрагмент молекули РНК має наступну послідовність:

5'-А-А-U-G-С-U-С-U-G-G-С-U-А-G-U-С-С-G-U-А-А-U-3'

Напишіть послідовність матричного ланцюга ДНК.

Розв’язок

Згідно з правилом комплементарності, аденін є комплементарним тиміну, а цитозин – гуаніну. В гібриді ДНК-РНК аденін утворює комплементарну пару з урацилом замість тиміну. Матричний ланцюг ДНК є комплементарним та антипаралельним до молекули РНК, що синтезується. Отже, послідовність матричного ланцюга можна записати у такому вигляді:

3'-Т-Т-А-С-G-А-G-А-С-С-G-А-Т-С-А-G-G-С-А-Т-Т-А-5'

Однак, зазвичай послідовності нуклеїнових кислот наводяться у напрямку 5'→3'. Таким чином, правильний запис послідовності наступний:

5'-А-Т-Т-А-С-G-G-А-С-Т-А-G-С-С-А-G-А-G-С-А-Т-Т-3'

Задача 2

Суспензія мікроорганізмів культивувалася у середовищі, яке містило [³Н]-мічений уридин. З цих клітин були ізольовані клітинні компоненти і проводилося вимірювання радіоактивності фракції мРНК, яке показало, що в мРНК 1×10⁶ клітин включилося 2,5 пікомоля уридина. Допустивши, що склад нуклеотидів мРНК є випадковим і що середня довжина мРНК складає 3000 нуклеотидів, розрахуйте, скільки молекул мРНК було синтезовано у кожній окремій клітині під час культивування (вважайте, що число Авогадро: 6×10²³).

Розв’язок

Помноживши 2,5 пікомоля уридина на число Авогадро, ми отримаємо загальну кількість уридину, що включився в синтезовані молекули мРНК: (2,5×10^-12)×( 6×10²³) = 15×10¹¹. Оскільки послідовності мРНК випадкові, то кількість інших нуклеотидів, включених в мРНК суспензії мікроорганізмів буде рівна (15×10¹¹)×4 = 6×10¹². Розділивши це число на кількість клітин у суспензії, отримаємо кількість нуклеотидів на одну клітину: (6×10¹²)/10⁶ =6×10⁶. Якщо довжина однієї мРНК в середньому рівна 3000 нуклеотидів, легко знайти кількість молекул у кожній окремій клітині: (6×10⁶)/3000=2000 молекул.

Задача 3

Еукаріотичний ген має 6 екзонів. Якщо позначити екзони літерою Е, а інтрони – І, поруч з якими стоїть їх порядковий номер, то ген схематично можна записати у вигляді: Е1-І1-Е2-І2-Е3-І3-Е4-І4-Е5-І5-Е6. Напишіть продукт сплайсингу мРНК за умов, якщо у третьому інтроні відбулася делеція, яка захоплює точку розгалуження.

Розв'язок

Розглянемо схему організації екзон/інтронних границь:

Мутації в консенсусних послідовностях на 5' та 3' кінцях інтронів, а також у точці розгалуження призводять до порушення сплайсингу мРНК – інтронна послідовність не вирізається. У нашому випадку нормальна мРНК повинна була містити 6 екзонів. Оскільки відбулась делеція, що захоплює точку розгалуження, то послідовність третього інтрону залишиться у складі зрілої мРНК. Кінцевій продукт можна представити у наступному вигляді:

Е1-Е2-ЕЗ-І3-Е4-Е5-Е6, де Е – позначення екзону, І – інтрону, поруч з якими стоїть їх порядковий номер.

Задачі для самостійного розв’язку

1. Фрагмент молекули РНК має наступну послідовність:

5'-А-А-U-G-С-U-С-U-G-G-С-U-А-G-U-С-С-G-U-А-А-U-3'

Напишіть послідовність кодуючого ланцюга ДНК.

2. Фрагмент кодуючого ланцюга ДНК має наступну послідовність:

5'-А-Т-А-С-Т-Т-А-С-Т-С-А-Т-Т-Т-Т-3'

Напишіть послідовність РНК, що синтезується.

3. Фрагмент матричного ланцюга ДНК має наступну послідовність:

5'-А-Т-А-С-Т-Т-А-С-Т-С-А-Т-Т-Т-Т-3'

Напишіть послідовність РНК, що синтезується.

4. Суспензія мікроорганізмів культивувалася у середовищі, яке містило [³Н]-мічений уридин. З цих клітин були ізольовані клітинні компоненти і проводилося вимірювання радіоактивності фракції мРНК, яка показала, що в мРНК 1×10⁵ клітин включилося 2 пікомоля уридина. Допустивши, що склад нуклеотидів мРНК є випадковим і що середня довжина мРНК складає 2000 нуклеотидів, розрахуйте, скільки молекул мРНК було синтезовано у кожній окремій клітині під час культивування (вважайте, що число Авогадро: 6×10²³).

5. Суспензія мікроорганізмів культивувалася у середовищі, яке містило [³Н]-мічений уридин. З цих клітин були ізольовані клітинні компоненти і проводилося вимірювання радіоактивності фракції мРНК. Розрахуйте, скільки молей міченого уридину включилося в 1 млн. клітин за умови, що в кожній клітині синтезується 1500 молекул РНК, з середню довжиною 3000 нуклеотидів (вважайте, що число Авогадро: 6×10²³).

6. Ген має 8 екзонів. Якщо позначити екзони літерою Е, а інтрони – І, поруч з якими стоїть їх порядковий номер, то ген схематично можна записати у вигляді: Е1-І1-Е2-І2-Е3-І3-Е4-І4-Е5-Е6-І6-Е7-І7-Е8. Напишіть продукт сплайсингу мРНК за умов, що у другому інтроні на 3' кінці відбулася заміна гуанозину на цитидин.

7. Ген має 5 екзонів. Якщо позначити екзони літерою Е, а інтрони – І, поруч з якими стоїть їх порядковий номер, то ген схематично можна записати у вигляді: Е1-І1-Е2-І2-Е3-І3-Е4-І4-Е5. Напишіть продукт сплайсингу мРНК за умов, що відбулася делеція трьох нуклеотидів на 5' кінці четвертого інтрону.

8. Ген має 7 екзонів. Якщо позначити екзони літерою Е, а інтрони – І, поруч з якими стоїть їх порядковий, номер, то ген схематично можна записати у вигляді: Е1-І1-Е2-І2-Е3-І3-Е4-І4-Е5-Е6-І6-Е7. Напишіть продукт сплайсингу мРНК за умов, що відбулася заміна аденозину на гуанідин за 10 нуклеотидів до точки розгалуження.