2. Прогресс в микроскопии. Методы изучения клеток и днк.

Основным приемом микроскопирования с самого начала появления микроскопа и до сих пор является метод светлого поля, при котором клетки изучают в проходящем свете. Однако, еще в 1837 г. Рид предложил метод темного поля, обладавший повышенным разрешением. Первый поляризационный микроскоп, позволяющий исследовать анизотропные структуры, был разработан в 1882 г. фон Эбнером. Флуоресцентная микроскопия, которая в наше время получила широкое распространение в сочетании с иммуноцитохимией, развилась благодаря работам Келера, Зидентопфа и Лемана (1904-1913). В 1936 г. шведский ученый Касперссон объединил в одну конструкцию микроскоп и спектрофотометр, что позволило исследовать спектры поглощения микроструктур и определять количество ДНК в одной клетке. С помощью этого прибора, который получил название микроспектрофотометр (цитофотометр), было показано постоянство содержания ДНК в соматических клетках и обнаружено ее удвоение перед делением (Свифт, 1950).

Разработанная Аббе теория микроскопа предсказывала, что использование волновых свойств электрона может обеспечить формирование изображений микроструктур размером менее 1 нм. Первый электронный микроскоп был построен в Высшей технической школе в Берлине в 1929-1931 гг. под руководством Кнолля, а изображение клетки в нем впервые получил фон Арденне в 1945 г. Во второй половине XX в. электронная микроскопия позволила исследовать тонкую структуру известных ранее клеточных компонентов, а также обнаружить ряд новых - гладкую и шероховатую плазматическую сеть, рибосомы, лизосомы, опушенные везикулы, секреторные гранулы, включения (Шестранд, Паладе, Сикевиц, де Дюв и др.).

Серьезным недостатком наиболее распространенных методов световой и электронной микроскопии является то, что они позволяют исследовать только фиксированные и окрашенные клетки. Однако из диффракционной теории известно, что прошедшая через нефиксированную и неокрашенную живую клетку световая волна содержит тоже информацию, которая закодирована в сдвигах волнового фронта. В 1934 г. немецкий оптик Цернике разработал метод фазового контраста, позволивший перевести эти сдвиги в различия интенсивности света и тем самым сделать их наблюдаемыми (Нобелевская премия по физике 1953 г.). В настоящее время усовершенствованный вариант этого метода - дифференциальный интерференционный контраст (DIC) - широко используется для наблюдений за живыми клетками.

Крупным событием в цитологии XX в. было изобретение конфокального микроскопа, позволяющего создавать трехмерные реконструкции клеток. Принцип конфокальной микроскопии был запатентован Марвином Мински в 1957 г., а первый прибор был изготовлен фирмой Био-Рад для изучения ориентации митотических фигур при дроблении в 1989 г. В настоящее время конфокальные микроскопы выпускают все ведущие фирмы - Цейсс, Олимпус, Никон, Лейка и др.

Успехи молекулярной и клеточной биологии, а также прогресс электроники, оптики и компьютерной техники стимулировали в конце XX в. разработку принципиально новых методов микроскопии, позволивших преодолеть диффракционный предел Аббе и получить разрешение в световом микроскопе, сопоставимое с разрешением электронного микроскопа.