Тема 3. Метаболизм аминокислот. Энзимопатии аминокислотного обмена

В живых организмах постоянно происходит интенсивное обновление белковых молекул. Образующиеся при гидролизе эндогенных белков аминокислоты могут использоваться для биосинтеза новых белков или для синтеза биологически важных азотсодержащих соединений (пуриновых и пиримидиновых оснований, некоторых гормонов и др.).

Белковый обмен в организме человека и животных в значительной мере зависит от поступления с пищей достаточного количества белков, содержащих полный набор незаменимых аминокислот (полноценные белки). Для человека незаменимыми аминокислотами являются лизин, аргинин, гистидин, валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, фенилаланин, триптофан.

Белки пищи, поступая в организм, подвергаются в пищеварительном тракте гидролитическому расщеплению до аминокислот, которые в результате всасывания в тонком кишечнике поступают в кровь, и, через воротную вену, далее в печень, где включаются в тканевой обмен. Часть аминокислот из печени поступает в систему кровообращения и утилизируется тканями, а часть дезаминируется и превращается или в ацетил-КоА (кетогенные аминокислоты), или в метаболиты цикла Кребса и пируват (гликогенные).

В тканях аминокислоты используются для синтеза белков или подвергаются дезаминированию, трансаминированию, декарбоксилированию, метилированию, в зависимости от того, используются они для синтеза специализированных биологически активных соединений (см. таблицу) или участвуют в энергетическом обмене.

Катаболизм большинства аминокислот начинается с реакций трансаминирования (обратимый перенос аминогруппы от -аминокислоты на -кетокислоту), катализируемых аминотрансферазами. Аминогруппы различных аминокислот при трансаминировании переносятся, в основном, на -кетоглутаровую кислоту с образованием глутаминовой кислоты, которая далее может подвергаться окислительному дезаминированию до иминокислоты, а затем гидролитически расщепляется на кетокислоту (-кетоглутаровая кислота) и аммиак. Эта реакция катализируется глутаматдегидрогеназой.

Аминокислоты	Производные
Суммарно	Белки, полипептиды, гормоны пептидной природы, нейромедиаторы и др.
Тирозин	Катехоламины, тироксин
Триптофан	Серотонин
Гистидин	Гистамин
Глутамат	-аминомасляная кислота
Глицин, аргинин, метионин	Креатин
Метионин, серин	Холин
Глицин	Порфирины
Глицин, аспартат	Нуклеотиды
Глицин, аланин, серин, триптофан, валин, аспартат, глутамат и др.	Углеводы
Фенилаланин, тирозин, лейцин, лизин, триптофан и др.	Липиды
Орнитин, цитруллин, аргинин, аспартат	Мочевина

Высвобождающийся аммиак используется для восстановительного аминирования кетокислот, синтеза пиримидиновых нуклеотидов и некоторых других веществ. При накоплении аммиак весьма ток­сичен и в организме имеется ряд механизмов, обезвреживающих аммиак. В печени осуществляется основной механизм обезвреживания аммиака – синтез мочевины, которая является главным конечным продуктом белкового обмена в организме человека и значительно менее токсична, чем другие азотсодержащие продукты обмена. Дополнительным механизмом является связывание аммиака глутаминовой и аспарагиновой кислотами с образованием амидов (глутамина и аспарагина). Глутамин представляет собой транспортную форму аммиака у животных. В виде глутамина аммиак транспортируется в печень и почки.

Исследование содержания небелкового азота сыворотки крови и мочи, а также соотношения белкового и небелкового азота в крови позволяют судить об обмене белков в организме и отдельных тканях, о балансе процессов биосинтеза и деградации белка. Основной вклад в небелковый азот крови вносят мочевина (50–60 %), а также свободные аминокислоты и нуклеотиды, креатин, билирубин, мочевая кислота. В общий азот мочи включают сумму всех азотсодержащих веществ: мочевина (80–90 %), аммонийные соли (4–6 %), креатинин (2–7 %), а также индикан, гиппуровая кислота, глюкуроновая кислота, мочевая кислота и свободные аминокислоты.

Лабораторная работа 10. Определение активности аминотрансфераз

Активность аминотрансфераз (прежде всего аланин- и аспартатаминотрансферазы – АлАТ и АсАТ соответственно) рассматривается как один из важных показателей обмена белков и аминокислот.

Принцип метода: при трансаминировании α-кетоглутарата и L-аланина под действием АлАТ, образуются пируват и L-глутаминовая кислота. Определение основано на измерении оптической плотности 2,4-динитрофенилгидразонов α-кетоглутарата и пирувата в щелочной среде. Поскольку гидразон пировиноградной кислоты имеет более высокий коэффициент молярной экстинкции, то проявляется прямо пропорциональная зависимость оптической плотности реакционного раствора от активности фермента.

Материалы и реактивы:

1. Субстратно-буферный раствор АлАТ:

фосфатный буфер (0,1  0,005) мМ,

D, L- аланин (0,2  0,01) М,

2-оксоглутаровая кислота (2  0,1) М;

2. Стоп–реагент (раствор 2,4-динитрофенилгидразина – (1  0,05) мМ в растворе соляной кислоты (1  0,05) мМ;

3. Калибровочный раствор – пировинограднокислого натрия (2  0,1) мМ, (220  11) мг/мл (что соответствует 176 мкг/мл пировиноградной кислоты);

4. Раствор гидроокиси натрия (4  0,2) М или сухой NaOH.

Ход работы:

Анализ проводиться согласно схеме, приведенной в таблице 1.

Таблица 1

Отмерять в пробирку, мл	Опытная или калибровочная проба	Холостая проба
Субстратно-буферный раствор	0,4	0,4
Инкубировать 3 мин при +37 0С
Стоп–реагент	–	0,4
Сыворотка крови	0,08	0,08
Инкубировать 60 мин при +37 0С
Стоп–реагент	0,4	–
Выдерживать 20 мин при комнатной температуре
Раствор гидроокиси натрия 0,4 Н	4,0	4,0
Выдерживать 10 мин при комнатной температуре. Измерить оптическую плотность опытной пробы против холостой при длине волны 500–550 нм.

Расчет активности фермента в сыворотке крови проводят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика проводится в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2. Калибровочный график для 1 часа инкубации

Отмерять в пробирку, мл	Калибровочные точки					Контроль­ная проба
	1	2	3	4	5
Субстратно-буферный раствор	0,45	0,40	0,35	0,30	0,25	0,5
Калибровочный раствор	0,05	0,10	0,15	0,2	0,25	–
Дистиллированная вода или физиологический раствор	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Стоп–реагент	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Выдержать 20 мин при комнатной температуре
Раствор гидроокиси натрия 0,4 Н	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Выдержать 10 мин. при комнатной температуре. Измерить оптическую плотность калибровочных проб против контрольной пробы. Фотометрирование проводится, как для опытного образца. При построении калибровочного графика на оси абсцисс – величины активности АлАТ, выраженные в микромолях пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации.
Содержание пировиноградной кислоты в калибровочной пробе
Мкмоль	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,0
Мкг	8,8	17,6	26,4	35,2	44,0	0,0
Активность в мкмоль/часмл	1,0	2,0	3,0	4,0	5,0	0,0
мккат/л	0,278	0,556	0,833	1,11	1,39	0,0

Линейность калибровочного графика должна сохраняться до величины экстинкции 0,35.

Нормальная активность АлАТ в сыворотке крови составляет (0,1–0,68) мкмоль/часмл при + 37 ⁰С.

Клинико-диагностическое значение. Диагностическое значение имеют две аминотрансферазы: АлАТ и АсАТ. Повышение их активности в крови является чувствительным показателем нарушения функций печени и сердца.

Для диагностики инфаркта миокарда проводят определение активности следующих ферментов: креатинкиназы, ЛДГ, АсАТ, АлАТ. При инфаркте миокарда активность АсАТ в сыворотке крови поднимается, начиная с 8–12 часа; максимальная активность достигается через 24–36 часов, а её возвращение к нормальному уровню происходит на 4–6 день. У больных с инфарктом миокарда активность АсАТ в сыворотке крови в 2–10 раз выше верхнего значения нормы. Соотношение активности АлАТ/АсАТ при инфаркте миокарда в большинстве случаев превышает 2, а соотношение меньше 1 преимущественно указывает на поражения печени.

Повышенная активность ферментов в сыворотке крови при заболеваниях печени является следствием повреждения гепатоцитов. Такие повреждения, независимо от причины, вызывают увеличение активности аминотрансфераз не менее, чем в 10 раз. Токсическое повреждение печени, например, при отравлении парацетамолом, приводит к повышению активности АлАТ и АсАТ в 50–100 раз. Значительное возрастание активности аминотрансфераз выявляют при вирусном гепатите.

Активность АлАТ и АсАТ при некоторых заболеваниях

Фер-мент	Заболевание
	Инфаркт миокарда	Стено- кардия	Мио-кардит	Острый гепатит	Хрони-ческий гепатит	Цирроз печени	Обтураци-онная желтуха
АсАТ	++	±	±	+	±	±	+ или ±
АлАТ	±	±	+	++	±	±	+ или ±
+ – норма ± – активность фермента повышена ++ – активность фермента сильно повышена

Лабораторная работа 11. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови и моче

Мочевина – основной конечный продукт азотистого катаболизма в организме млекопитающих. Содержание мочевины в плазме крови – важный показатель состояния печени, где она образуется при обезвреживании аммиака, и почек, регулирующих ее поступление в мочу (при этом некоторая часть ее может реабсорбироваться). Кроме того, концентрация мочевины отражает соотношение между азотистым катаболизмом и анаболизмом в организме.

Принцип метода: Мочевина образует с диацетилмонооксимом в кислой среде в присутствии тиосемикарбазида и солей Fе³⁺ комплекс красного цвета, по интенсивности окраски которого определяют концентрацию мочевины.

Материалы и реактивы:

1. раствор диацетилмонооксима;

2. раствор тиосемикарбазида;

2) калибровочный раствор мочевины – 16,65 мМ;

3) раствор трихлоруксусной кислоты 50 %;

4) раствор серной кислоты 15 %.

Анализируемый образец: сыворотка крови, моча (разведенная в 50 или 100 раз)

.Ход работы: работу проводят согласно таблице.

	Опытная проба	Эталон	Холостая проба
Сыворотка крови или развед. моча	0,02	–	–
Эталон мочевины (раствор)	–	0,02	–
Физиологический раствор	–	–	0,02
Раствор диацетилмонооксима	2,0	2,0	2,0
Раствор тиосемикарбазида	2,0	2,0	2,0

В пробирки отмеряют последовательно, согласно таблице, анализируемый образец и рабочие растворы. Для уменьшения ошибки анализа рекомендуется придерживаться указанного порядка смешивания растворов.

Пробирки закрыть алюминиевой фольгой и поставить в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем охладить их и измерить на ФЭКе оптическую плотность пробы (Е_опыт) и эталона (Е_эталон) против холостой пробы при длине волны 540–560 нм.

Расчет концентрации мочевины в опытной пробе

,

где С_эталон – концентрация мочевины в эталоне – равна 16,65 мМ

В норме содержание мочевины в сыворотке крови составляет 1,7–8,32 мМ, 10–50 мг/дкл.

Расчет мочевины в суточной моче:

Сг/сутки=С_опыт,

где А – суточное количество мочи, мл;

В – количество мочи, взятое для анализа, мл;

К – коэффициент разведения мочи;

1000 – коэффициент перевода величины экскреции мочевины из мг в г.

В норме содержание мочевины в моче составляет 333–583 мМ/сутки, 20–35 г/сутки.

Клинико-диагностическое значение. Отклонения от нормального содержания мочевины зависит от скорости процессов синтеза мочевины и её выведения. Содержание мочевины в сыворотке крови и моче может изменятся вследствие поражения некоторых органов, главным образом печени и почек.

Повышенное содержание мочевины в сыворотке крови – уремию – наблюдают при заболеваниях почек. При этом содержание мочевины в моче уменьшается. Уремию наблюдают также при патологиях, которые сопровождаются интенсивным распадом белка (сепсис, туберкулёз, ожоги, перитониты). Содержание мочевины в моче при этом возрастает.

Кроме того, возрастание уровня мочевины в сыворотке крови может происходить в случае потери жидкости (рвота, диарея, обезвоживание).

Нарушение мочевинообразующей функции печени вследствие цирроза, острого жирового гепатоза, отравления фосфором, мышьяком и другими ядами приводит к уменьшению синтеза мочевины, снижению содержания её в крови и уменьшением выведения её с мочой. В этих случаях увеличивается выделение с мочой и других азотсодержащих веществ: аминокислот, креатинина, аммиака и т. д.

Содержание мочевины в биологических жидкостях зависит также от характера питания: при употреблении богатой белками пищи содержание мочевины в сыворотке крови и моче увеличивается, в случае безбелковой диеты – уменьшается.

Уровень мочевины в биологических жидкостях может изменяться под действием некоторых препаратов. Увеличивается содержание мочевины в крови при приёме анаболических стероидов, а также под действием нефротоксичных лекарственных препаратов.

Контрольные вопросы по теме «Метаболизм аминокислот. Энзимопатии аминокислотного обмена»:

1. Пул свободных аминокислот в организме: пути поступления и использование свободных аминокислот в тканях.

2. Трансаминирование аминокислот: реакции и их биохимическое значение, механизмы действия аминотрансфераз.

3. Прямое и косвенное дезаминирование свободных L-аминокислот в тканях.

4. Декарбоксилирование L-аминокислот в организме человека. Физиологическое значение образовавшихся продуктов. Окисление биогенных аминов.

5. Пути образования и обезвреживания аммиака в организме.

6. Биосинтез мочевины: последовательность ферментных реакций биосинтеза, генетические аномалии ферментов цикла мочевины.

7. Общие пути метаболизма углеродных скелетов аминокислот в организме человека. Глюкогенные и кетогенные аминокислоты.

8. Биосинтез и биологическая роль креатина и креатинфосфата. Креатинин.

9. Глутатион: строение, биосинтез и биологические функции глутатиона.

10. Специализированные пути метаболизма циклических аминокислот – фенилаланина и тирозина.

11. Наследственные энзимопатии обмена циклических аминокислот – фенилаланина и тирозина.

12. Обмен циклической аминокислоты триптофана и его наследственные энзимопатии.

МОДУЛЬ 3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ. БИОХИМИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОММУНИКАЦИЙ