Тема 3, 4. Основные закономерности метаболизма. Цикл Кребса. Молекулярные основы биоэнергетики

Метаболизмом называют всю совокупность химических реакций в живых клетках. В более узком смысле «метаболизм» означает промежуточный обмен, то есть превращение веществ внутри клеток с момента их поступления до образования конечных продуктов. Промежуточные продукты называют метаболитами или интермедиатами.

Центральные метаболические пути сходны у всех живых форм (принцип биохимического единства) и обеспечивают: а) приток химической энергии за счет расщепления пищевых веществ или преобразования энергии солнечного света; б) синтез строительных блоков для построения макромолекул; в) сборку клеточных компонентов.

Промежуточный обмен складывается из двух противоположных фаз: катаболизм и анаболизм. В ходе катаболизма происходит расщепление сложных органических молекул до более простых конечных продуктов, что сопровождается запасанием значительной части свободной энергии в виде высокоэнергетических (макроэргических) соединений. Анаболические процессы включают биосинтез строительных блоков и макромолекулярных компонентов клетки, что сопрягается с реакциями распада макроэргических соединений (прежде всего, нуклеозидтрифосфатов). Скорости катаболических и анаболических реакций тонко регулируются в соответствии с потребностями организма и условиями внешней среды.

Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК, цикл Кребса) – это общий конечный путь катаболизма клеток в аэробных условиях. Ферменты, катализирующие реакции ЦТК, локализованы в матриксе и внутренней мембране митохондрий. ЦТК начинается с конденсации двухуглеродной молекулы ацетил-КоА и четырёхуглеродного оксалоацетата, что приводит к образованию шестиуглеродного цитрата. В результате дальнейших превращений три- и дикарбоновых кислот (интермедиатов ЦТК) происходит регенерация оксалоацетата и выделяются две молекулы углекислого газа.

ЦТК является амфиболическим путем. Амфиболический путь сочетает в себе катаболические и анаболические реакции. В цикле Кребса не только осуществляются окислительные превращения энергетических субстратов до конечных продуктов, но и происходит образование субстратов для других метаболических путей.

Процессы катаболизма в клетках животных сопровождаются потреблением кислорода, который необходим для реакций окисления. Электроны и протоны переходят от органических субстратов на коферменты НАД- и ФАД-зависимых дегидрогеназ, а далее переносятся на кислород через цепь переносчиков, организованных в дыхательную цепь митохондрий. Электроны перемещаются по цепи от более электроотрицательных компонентов к наименее электроотрицательному кислороду.

Компоненты дыхательной цепи встроены во внутреннюю мембрану митохондрий в виде четырёх ферментативных комплексов:

I комплекс (НАДН-убихинон-редуктаза): флавопротеин, содержащий ФМН, который окисляет НАДН и передаёт восстановительные эквиваленты на убихинон; ассоциирован с железосерными белками (FeS-белками).

Убихинон – небольшая липофильная молекула, которая способна перемещаться в мембране и транспортировать протоны и электроны между мембраносвязанными комплексами дыхательной цепи.

II комплекс (сукцинат-убихинон-редуктаза): ФАД-зависимый флавопротеин, который окисляет сукцинат, восстанавливая убихинон; ассоциирован с FeS-белками.

III комплекс (убихинон-цитохром с-редуктаза): состоит из цитохрома b, FeS-белков и цитохрома с₁, передаёт электроны с восстановленного убихинона на цитохром с.

Цитохром с – единственный растворимый цитохром, который, наряду с убихиноном, служит мобильным компонентом дыхательной цепи, осуществляющим связь между фиксированными комплексами.

IV комплекс (цитохром с-оксидаза): состоит из цитохромов а и а₃, которые содержат ионы меди. Этот комплекс обеспечивает перенос восстановительных эквивалентов на молекулярный кислород с образованием воды.

Согласно хемиосмотической теории I, III и IV белковые комплексы дыхательной цепи при переносе электронов выкачивают протоны из матрикса митохондрий в межмембранное пространство, создавая электрохимический градиент, который далее используется АТФ-синтетазой для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Окисление одной молекулы НАДН(H⁺) обеспечивает синтез 3 молекул АТФ, при окислении ФАДH₂ – 2 АТФ. Зависимость интенсивности дыхания митохондрий от концентрации АДФ называют дыхательным контролем.

Многие заболевания людей и животных связаны с нарушением энергетического обмена. Нарушение энергетических процессов может быть вызвано многими причинами:

• недостаточность субстратов окисления, невозможность их использования,

• недостаточность ферментов дыхательной цепи, в том числе из-за нехватки витаминов, производные которых входят в ее состав в виде коферментов,

• блокирование процессов окислительного фосфорилирования и образования АТФ,

• токсические поражения, при которых нарушается проницаемость митохондриальных мембран,

• дефицит кислорода.

Нарушение регуляции энергетических процессов наблюдают при гипогликемии, когда в крови снижается содержание глюкозы – важного источника энергии в организме (при голодании, тяжелой физической нагрузке, потреблении алкоголя). Гипогликемия неблагоприятно влияет на функции мозга: развивается гипогликемический шок, потеря сознания, спазмы сосудов головного мозга, температура тела снижается.

Пример патологии, обусловленной нарушением энергетического обмена, – лихорадка. Повышение температуры тела связано, как правило, с бактериальной или вирусной инфекцией. Лихорадку вызывают пирогены, выделяемые бактериями. Эти вещества разобщают процессы тканевого дыхания и фосфорилирования. При этом уменьшается образование АТФ и энергия, которая не используется для фосфорилирования АДФ, выделяется в виде тепла.

Лабораторная работа 8. Исследование сукцинатдегидрогеназы мышц

Сукцинатдегидрогеназа мышц – это железофлавопротеин, катализирующий окисление (дегидрирование) янтарной кислоты в фумаровую. Коферментом сукцинатдегидрогеназы служит флавинадениндинуклеотид (ФАД). Активность фермента зависит от наличия в нем свободных сульфгидрильных групп и атомов железа.

В качестве источника фермента используется отмытая мышечная ткань. Действие этого фермента можно выявить при добавлении к янтарной кислоте метиленового синего или 2,6-дихлорфенолиндофенола, выступающих в качестве акцепторов водорода, которые обесцвечиваются при восстановлении.

Конкурентное торможение активности этого фермента вызывает малоновая кислота НООС–СН₂–СООН, являющаяся структурным аналогом янтарной кислоты.

Материалы и реактивы: свежая мышечная ткань, 0,01 N раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ), 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), 0,1 N раствор едкого натра, 3 % раствор малоновой кислоты.

Ход работы. Свежую мышечную ткань (1 г) измельчить ножницами и растереть в ступке с небольшим количеством воды (2–3 мл) в течение 1 мин. Полученный гомогенат перенести на двойной слой марли, размещенной на воронке, промыть водой, высушить на фильтровальной бумаге.

В три пробирки налить по 3 мл фосфатного буфера и поместить в них по 0,1 г мышечного гомогената. Затем в опытную пробирку добавить 5 капель 3 % раствора янтарной кислоты и, для нейтрализации, 5 капель 0,1 N раствора едкого натра, а в контрольную – 10 капель дистиллированной воды. В третью пробирку добавить 5 капель 3 % раствора малоновой кислоты, 5 капель 3 % раствора янтарной кислоты и 5 капель 0,1 N раствора едкого натра. Во все пробирки добавить по 1 мл 0,001 N раствора 2,6-ДХФИФ. Хорошо перемешать. Пробы поместить в термостат при 37 ⁰С на 40 мин.

Наблюдается обесцвечивание содержимого в первой пробирке. Сравнить ее с контролем и пробиркой, в которой находился конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы – малоновая кислота. Время обесцвечивания 2,6-ДХФИФ при наличии янтарной кислоты характеризует активность сукцинатдегидрогеназы.

Лабораторная работа 9. Исследование цитохромоксидазы мышц

Цитохромоксидаза – фермент, относящийся к оксидоредуктазам. Она завершает дыхательную цепь, окисляя цитохром с путем переноса электронов на кислород воздуха. По химической природе цитохромоксидаза – это гемопротеин, содержащий медь.

Выявление цитохромоксидазы основано на ее способности окислять при участии кислорода воздуха не только цитохромы, но и некоторые органические соединения, в частности, парафенилендиамин и -нафтол (реактив НАДИ). При окислении двух последних соединений образуется окрашенный продукт – индофенол синий.

Материалы и реактивы: мышечная ткань, 1 % водный раствор n-фенилендиамина, 1 % спиртовой раствор -нафтола.

Ход работы. Взять 0,5–0,7 г свежей мышечной ткани, измельчить ножницами, поместить в ступку с 20-кратным объемом дистиллированной воды и растереть в течение 10 мин. Воду осторожно слить, а твердый остаток фильтровать через двойной слой марли. Мышечный гомогенат промывать водой, пока она не станет прозрачной.

Отмытый от водорастворимых ферментов гомогенат мышечной ткани разделить на две части. Одну часть поместить на фильтровальную бумагу, а вторую – в пробирку, куда добавить 1 мл дистиллированной воды и кипятить 1 мин. После охлаждения жидкость осторожно слить в пробирку, оставшийся мышечный гомогенат перенести стеклянной палочкой на фильтровальную бумагу.

На оба кусочка мышц нанести по 1–2 капли индофенольного реактива «НАДИ». Через 5–10 мин на кусочке, который не кипятили, появляется сине-фиолетовая окраска как результат реакции окисления и конденсации -нафтола и парафенилендиамина. Эта реакция катализируется цитохромоксидазой мышц. На прокипяченном кусочке мышц реакция отрицательная из-за тепловой денатурации фермента.

Контрольные вопросы по теме «Основные закономерности обмена веществ. Цикл трикарбоновых кислот»:

1. Обмен веществ (метаболизм) – общие закономерности протекания катаболических и анаболических процессов.

2. Общие стадии внутриклеточного катаболизма биомолекул: белков, углеводов, липидов.

3. Цикл трикарбоновых кислот. Локализация, последовательность ферментативных реакций, значение в обмене веществ.

4. Энергетический баланс цикла трикарбоновых кислот. Физиологическое значение реакций ЦТК.

Контрольные вопросы по теме «Молекулярные основы биоэнергетики»:

1. Реакции биологического окисления, типы реакций (дегидрогеназные, оксидазные, оксигеназные) и их биологическое значение. Тканевое дыхание.

2. Ферменты биологического окисления в митохондриях: пиридин-, флавинзависимые дегидрогеназы, цитохромы.

3. Последовательность компонентов дыхательной цепи митохондрий. Молекулярные комплексы внутренних мембран митохондрий.

4. Окислительное фосфорилирование: пункты сопряжения транспорта электронов и фосфорилирования, коэффициент окислительного фосфорилирования.

5. Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования, АТФ-синтетаза митохондрий.

6. Ингибиторы транспорта электронов и разобщители окислительного фосфорилирования.

МОДУЛЬ 2. МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ, ЛИПИДОВ, АМИНОКИСЛОТ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ