Тема 1, 2. Основы молекулярной биологии. Основы молекулярной генетики

Нуклеиновые кислоты — биополимеры, мономерами которых являются нуклеотиды, соединенные между собой фосфодиэфирными связями. Нуклеотиды состоят из трех компонентов: азотистого основа­ния (аденина, гуанина, цитозина, урацила или тимина), моносахарида (D-рибозы или 2-дезокси-D-рибозы) и фосфорной кислоты. В зависимости от типа мономерных звеньев (дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды), входящих в состав нуклеиновых кислот, различают дезоксирибонуклеиновые (ДНК) и рибонуклеиновые (РНК) кислоты. Молекулы ДНК, как правило, состоят из 2-х полинуклеотидных цепей, тогда как молекулы РНК, в основном, одноцепочечные.

Оба типа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) присутствуют во всех клеточных организмах, и только вирусы могут содержать один тип полимера.

Функции нуклеиновых кислот состоят в хранении, передаче и реализации генетической информации.

У эукариотических организмов ДНК локализована, в основном, в ядрах клеток, у прокариот она образует нуклеоид, в котором содержится вся бактериальная хромосома. Митохондрии и хлоропласты содержат свою собственную ДНК. Кроме того, в цитоплазме многих прокариот и низших эукариот обнаружены внехромосомные ДНК – плазмиды.

В клетках как про-, так и эукариот РНК бывают трех основных типов: информационная (матричная, мРНК), транспортная (тРНК) и рибосомная (рРНК). мРНК является матрицей для синтеза белка. тРНК переносят специфические аминокислоты к месту белкового синтеза и, собственно, переводят последовательность нуклеотидов мРНК в последовательность аминокислотых остатков полипептида. рРНК являются структурно-функциональной основой рибосом.

Лабораторная работа 1. Определение состава нуклеопротеидов

В клетке нуклеиновые кислоты, в основном, находятся в комплексе с белками, т. е. в виде нуклеопротеидов. В зависимости от типа нуклеиновой кислоты различают дезоксирибонуклеопротеиды – хроматин, и рибонуклеопротеиды – рибосомы, информосомы, РНК-содержащие вирусы.

Гидролиз нуклеопротеидов дает возможность установить их химический состав с помощью качественных реакций.

Одним из источников для выделения нуклеопротеидов являются дрожжи.

1. Биуретовая реакция. К 5-ти каплям гидролизата добавить 10 капель 10 % раствора NaOH и 1 каплю СuSO₄. Фиолетовое окрашивание свидетельствует о наличии в гидролизате пептидов.

2. Проба на пуриновые основания. 10 капель гидролизата нейтрализовать одной каплей концентрированного раствора NH₄OH и добавить 5 капель 1 % раствора АgNО₃. Через несколько минут образуется рыхлый осадок соединений пуриновых оснований с серебром, окрашенный в бурый цвет.

3. Качественная реакция на углеводный компонент. К 5–7 каплям гидролизата добавить 1–2 капли -нафтола, перемешать и осторожно наслоить 0,5 мл концентрированной H₂SO₄. На границе раздела жидкостей появляется фиолетовое коль­цо, свидетельствующее о наличии углеводного компонента в нуклеопротеидах.

4. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 10-ти каплям молибденового реактива (раствор молибдата аммония в азотной кислоте) добавить 5 капель гидролизата и кипятить смесь на пламени горелки. В присутствии фосфорной кислоты жидкость окрашивается в лимонный цвет. После охлаждения в струе воды наблюдается появление желтого кристаллического осадка образовавшегося фосфомолибдата аммония.

Лабораторная работа 2. Определение концентрации мочевой кислоты

Переваривание нуклеопротеидов пищи начинается в желудке, где под действием пепсина и соляной кислоты они распадаются на полипептиды и нуклеиновые кислоты. Последние под влиянием ферментов тонкого кишечника гидролизуются сначала до мононуклеотидов, а затем до нуклеозидов и фосфорной кислоты. В кишечнике осуществляется всасывание, в основном, нуклеозидов, но возможен и дальнейший распад нуклеозидов до свободных азотистых оснований и пентоз, которые затем поступают в кровяное русло.

И нуклеозиды, и свободные азотистые основания могут частично использоваться для синтеза нуклеиновых кислот и нуклеотидов, однако поступление в организм с пищей азотистых оснований, по-видимому, не имеет решающего значения. Синтез нуклеиновых кислот определяется скоростью синтеза гетероциклических оснований de novo из низкомолекулярных азотистых и безазотистых предшественников: аспарагиновой кислоты и карбамоилфосфата – для пиримидиновых нуклеотидов, и активированной формы рибозы, глицина, глутамина, СО₂, аспарагиновой кислоты и производных тетрагидрофолата – для пуриновых нуклеотидов.

В тканях, прежде всего в печени, свободные пуриновые основания как экзогенного, так и эндогенного происхождения подвергаются катаболизму с образованием мочевой кислоты – конечного продукта пуринового обмена у человека и большинства приматов, птиц и некоторых рептилий. Конечными продуктами распада пиримидинов являются СО₂, аммиак (выводится в виде мочевины), -аланин и -аминоизомасляная кислота. Существует сложная система регуляции синтеза, повторного использования и распада азотистых оснований. Нарушения этих регуляторных механизмов особенно резко сказываются на обмене пуринов. Снижение биосинтеза пуринов вызывает ограничение роста и размножения клеток, тогда как усиленный распад пуринов до мочевой кислоты, которая обладает плохой растворимостью в воде, сопровождается ее отложением в суставах (подагра). В норме образующаяся в печени и тканях при окислении пуринов мочевая кислота по­ступает в кровь и затем через почки вместе с мочой вы­деляется из организма.

Принцип метода: мочевая кислота в щелочной среде восстанавливает фосфорновольфрамовый реактив в краситель синего цвета. Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации мочевой кислоты в анализируемой пробе.

Материалы и реактивы:

1. Фосфорно-вольфрамовый реактив: Na₂WO₄ – (0,12  0,01) М,

H₃PO₄ – (0,47  0,05) М,

Li₂SO₄ – (0,29  0,02) М;

2. Кислота серная (0,35  0,02) М

3. Вольфрамат натрия (0,30  0,1) М

4. Калибровочный раствор мочевой кислоты (300  3) мкМ

или 0,05 г/л

5. Карбонат натрия

Образец: сыворотка крови, негемолизированная плазма крови; моча, разведенная дистиллированной водой в 10 раз.

Ход работы. Анализ проводится в соответствии со схемой, представленной в таблице.

Отмерить в кювету, мл	Опытная проба	Калибр. проба	Холостая проба
Дистиллированная вода	4,0	4,0	4,5
Сыворотка (плазма), разбавленная моча	0,5	–	–
Калибровочный раствор мочевой кислоты	–	0,5	–
Кислота серная	0,25	0,25	0,25
Вольфрамат натрия	0,25	0,25	0,25
Перемешать, выдержать 10  1 мин. при комнатной температуре (от +20 до +25 0С), центрифугировать 10  1 мин при 2000–5000 об/мин, отобрать необходимое количество центрифугата (вместо центрифугирования допускается фильтрование полученного раствора).
Центрифугат (фильтрат)	3,0	3,0	3,0
Раствор карбоната натрия	1,5	1,5	1,5
Фосфорновольфрамовый реактив	1,0	1,0	1,0
Перемешать, выдержать 30  2 мин. при комнатной температуре (от +20 0С до +25 0С), измерить оптическую плотность опытной Епробы и калибровочной пробы Екалиб. против холостой в кюветах толщиной 10 мм при длине волны 650 нм. Окраска стабильна в течение 30  2 мин.

Расчет результатов:

С (мкМ) = 300  Е_пробы /Е_{калибр.} или

С (г/л) = 0,05  Е_пробы /Е_{калибр.}

Для расчета концентрации мочевой кислоты в моче полученное значение (С) необходимо умножить на коэффициент разведения – 10.

Клинико-диагностическое значение. В норме с мочой у человека выделяется 1,60–3,54 ммоль/сутки (270–600 мг/сут) мочевой кислоты. Нормальная концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови составляет для мужчин 240–530 мкМ (0,05–0,06 г/л), для женщин на 25 % меньше – 185–440 мкМ (0,04–0,05 г/л).

Концентрация мочевой кислоты в крови увеличивается при тяжелой мышечной работе, приеме пищи, богатой нуклеопротеидами, а также при лейкемии, анемии и ряде других заболеваний.

При подагре (отложение в тканях кристаллов уратов, вызванное врождёнными энзимопатиями) наблюдается особенно резкое увеличение концентрации мочевой кислоты в крови, концентра­ция ее может повышаться до 0,2 г/л и более. Кристаллы уратов приводят к высвобождению в экстрацеллюлярное пространство как цитоплазматических, так и лизосомальных ферментов; в тканях развивается асептическое воспаление.

Для лечения подагры используют препараты, тормозящие образование мочевой кислоты (аллопуринол) или стимулирующие их выведение почками (антуран, цинхофен, атофан).

Уменьшение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови наблюдают при болезни Коновалова–Вильсона, некоторых злокачественных новообразованиях, употреблении таких препаратов, как салицилаты, пиперазин, атофан, кортикотропин.

Контрольные вопросы по теме «Основы молекулярной биологии»:

1. Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды – составляющие компоненты молекул нуклеиновых кислот. Минорные азотистые основания и нуклеотиды.

2. Свободные нуклеотиды (АТФ, НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, ЦТФ, УТФ, 3’,5’-АМФ, 3’,5’-ГМФ) и их биохимические функции.

3. Нуклеиновые кислоты. Общая характеристика ДНК и РНК, их биологическое значение в сохранении и передаче генетической информации.

4. Особенности первичной структуры ДНК и РНК. Связи, которые стабилизируют первичную структуру нуклеиновых кислот.

5. Вторичная структура ДНК, роль водородных связей в ее образовании (правила Чаргаффа, модель Уотсона–Крика), антипараллельность цепей.

6. Третичная структура ДНК. Физико-химические свойства ДНК: взаимодействие ДНК с катионными лигандами, образование нуклеосом.

7. Молекулярная организация ядерного хроматина эукариотов: нуклеосомная организация; гистоновые и негистоновые белки.

8. Строение, свойства и биологические функции РНК. Типы РНК: мРНК, тРНК, рРНК. Особенности структурной организации различных типов РНК.

9. Нуклеопротеиды: строение, биологические функции.

10. Биосинтез пуриновых нуклеотидов: схема реакций синтеза ИМФ; образование АМФ и ГМФ; механизмы регуляции.

11. Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов: схема реакций, регуляция синтеза.

12. Биосинтез дезоксирибонуклеотидов. Образование тимидиновых нуклеотидов, ингибиторы биосинтеза дТМФ как противоопухолевые средства.

13. Катаболизм пуриновых нуклеотидов; наследственные нарушения обмена мочевой кислоты.

14. Схема катаболизма пиримидиновых нуклеотидов.

15. Репликация ДНК: биологическое значение; полуконсервативный механизм репликации.

16. Последовательность этапов и ферменты репликации ДНК у прокариотов и эукариотов.

17. Транскрипция: РНК-полимеразы прокариотов и эукариотов, сигналы транскрипции (промоторные, инициаторные и терминальные участки генома).

18. Процессинг – посттранскрипционная модификация синтезированных мРНК.

19. Генетический (биологический) код; триплетная структура кода, его свойства.

20. Транспортные РНК и активация аминокислот. Аминоацил-тРНК-синтетаза.

21. Этапы и механизмы трансляции (биосинтеза белка) в рибосомах: инициация, элонгация и терминация. Процессинг.

Контрольные вопросы по теме «Основы молекулярной генетики»:

1. Посттрансляционная модификация пептидных цепей. Регуляция трансляции.

2. Ингибиторы транскрипции и трансляции у прокариотов и эукариотов: антибиотики и интерфероны – их применение в медицине; дифтерийный токсин.

3. Регуляция экспрессии генов прокариотов: регуляторные и структурные участки лактазного (Lac-) оперона (регуляторный ген, промотор, оператор).

4. Мутации: геномные, хромосомные, генные; механизмы действия мутагенов; роль индуцированных мутаций в возникновении энзимопатий и наследственных болезней человека.

5. Биологическое значение и механизмы репарации ДНК. Репарация УФ-индуктированных генных мутаций: пигментная ксеродерма.

6. Генная инженерия: конструирование рекомбинантных ДНК; клонирование генов; генно-инженерный синтез ферментов, гормонов, интерферонов и др.