3.8. Рестрикція фрагментів отриманих після виділення днк

Для ідентифікації того, що виділена плазміда відповідає бажаній, провели рестрикційний аналіз.

Рестриктази підбираються так, щоб утворювалося два фрагменти для точної ідентифікації. Рестриктази HincIII і NcoI ріжуть плазміду зі вставкою на 2 фрагменти: 3160 і 1300 bp. З рис. 3.7 видно, що результат рестрикції відповідає очікуваному, а відтак підтвердьжена наявність нашої вставки і достовірність отриманих результатів.

1 2 3 4 5

М

3000

Рис. 3.7. Результати рестрикції фрагментів рестриктазами HincIII і NcoI:

1 – 5 – продукти рестрикції;

М – маркер.

Наступним етапом було виділення плазміди у великих об’ємах. На рис. 3.8 зображена електрофореграма виділеної плазміди. Видно, що фрагмент відповідає очікуваним розмірам і підтверджує успішність виділення плазміди.

1 2

М

Рис. 3.8. Електрофореграма плазміни, виділеної максі препаративним методом

1 - рGEM-3Z зі вставкою гена люциферази;

2 – маркер.

Було повторно проведено рестрикційний аналіз отриманого фрагменту рестриктазами HincIII і NcoI, що остаточно підтвердило правильність проведення попередніх етапів експерименту.

3.9. Проведення in vitro транскрипції

In vitro транскрипція проводилась за методом, що описаний в розділі 2.

Провівши рестрикцію плазміди за сайтом рестриктази EcoR I, ми отримали лінійний фрагмент, який зчитувався SP6 РНК – полімеразою (рис. 1.6.). В результаті реакції було отримано фрагменти розміром 1790 bp, що було перевірено електрофорезом у денатуруючому 1% агарозномуц гелі.

В якості маркера використовувалась тотальна РНК.. Довжина 18S рибосомальної РНК дорівнює 1874 н. і є співрозмірною до цільового фрагменту.

1 2

1790

Рис. 3.9. Продукт реакції in vtro транскрипції в порівнянні з рибосомальною РНК:

1 – продукт реакції зворотної транскрипції;

2 – тотальна 18S НК.