2.2. Методи дослідження

2.2.1. Літературний пошук потенціальних референтних генів для плаценти.

Бла-бла-бла

2.2.2. Підбір праймерів.

Від підбору праймерів залежить якість і відповідність утворених продуктів. По можливості, праймери мають мати співвідношення Г/Ц пар від 30% до 80%.

Олігонуклеотиди з більшою кількістю Г/Ц можуть не денатурувати при проходженні реакції, що призводить до зниження ефективності реакції. Також, Г/Ц пари можуть мати високу чутливість до неспецифічних взаємодій, таких, як шпильки, петлі. Це призводить до виникнення неспецифічного сигналу і спотворює кінцевий результат.

Також рекомендується, щоб на 3`-кінці праймера має бути не більше двох цитозинових і гуанінових основ, для зниження можливості утворення неспецифічних продуктів.

Ідеальною температурою плавлення для праймерів є 58˚С до 65˚С, що дозволяє використовувати універсальні параметри циклів для роботи Taq – полімерази - 72˚С.

На праймерах має бути мінімальна кількість паліндромів, так як може відбуватись замикання праймерів на себе, а також енергія взаємодії праймерів між собою має бути мінімальною.

2.2.3. Рестрикція плазмід pGem–3z I pGel-3-Basic.

До 5 мкг плазмід pGEM–3Z i pGEL-3-Basic (що знаходяться в окремих епендорфах), додавали рестриктазу Hind III, 10х-буфер(окремий для кожної рестриктази), та воду до 100 мкл. Інкубували протягом 3 годин при температурі 37°С. Після завершення часу інкубації, інактивували реакцію для Hind III при 80°С 10 хв. Результат реакції аналізували за допомогою горизонтального ДНК – електрофорезу в агарозному гелі. Потрібний фрагмент виділяли із геля за допомогою набору GeneJET PCR Purification Kit. Рестрикцію другою рестриктазою (Xba I) проводили за тією ж схемою, але в загальному об’ємі, що дорівнює 60 мкл. Інактивували реакцію при 65°С – 20 хв. На форезі знаходили смуги, що відповідали потрібним фрагментам і вирізали їх з гелю. Очистку проводили на колонці Fermentas Gene Jet PCR (Thermo Scientific, USA).

2.2.4. Проведення лігування

Загальним об’єм реакції складає 20 мкл. В епендорф, де містилися плазміди pGEM–3Z (концентрація 39.6 fmol) i pGEL-3-Basic (186.7 fmol), додавали ДНК-лігазу, 10х-буфер, ATP(10 mM) і воду. Залишали на ніч при кімнатній температурі. Після лігування реакцію зупиняли при 70°С – 5 хв.

Трансформація компетентних клітин. Аліквоти компетентних клітин (50 мкл) E. Coli (XL-Blue) розморожували на льоду. Впевнившись, що клітини повністю розморозились, додавали потрібну кількість плазміди (після проведення лігування). Клітини з ДНК інкубували на льоду протягом 30 хв, після чого прогрівали 30 сек. при 42С і знову поміщали на льодяну баню на 2 хв. До суспензії клітин додавали 250 мкл середовища S.O.C., в якому їх інкубували 45 хв за 37 С з інтенсивною аерацією (250 об/хв). Після цього по 100 мкл культури висівали методом суцільного газону на агар LB. Бактерії вирощували протягом 16 годин за 37 С.

Для селекції колоній було використано антибіотик ампіцилін (Amp), кінцева концентрація якого у середовищі становила 100 мкг/млю Для проведення біло-блакитної селекції у середовище додавали 40 мкг/мл X-Gal (5-бромо-4-хлоро-индолі-β-D-галактозид – хромогенний субстрат β‑галактозидази) та 50 мкг/мл iзопропіл--D-тіогалактопіранозиду (IPTG – аналог аллолактози, метаболіт лактози, який запускає транскрипцію lac‑оперона; зв’язується та інгібує lac-репресор і таким чином індукує продукцію β-галактозидази). Метод біло-блакитної селекції грунтується на тому, що при інсерції в полілінкер вектора чужерідної ДНК порушуєтсья послідовність гена -галактозидази, і таким чином унеможливлюється гідроліз субстрату даного ферменту (X-Gal) до продуктів синього кольору.