1.5. Експланти як експериментальна модель для дослідження плаценти людини
Культури тканин широко використовуються в якості моделей для дослідження тканинних функцій. Експлант – шматочок живої тканини, що взятий з організму та поміщений в штучне поживне середовище. В ньому зберігаються анатомічний зв'язок між клітинами та міжклітинний матрикс тієї тканини, з якої його було взято [42] (рис.1.9 ).
Рис.1.11.Схематичне зображення експланта плаценти (за Miller et al, 2005).
Експланти одержують з таких тканин і органів як ендотелій, плацента, підшлункова залоза, бронхи [43]. На відміну від культури клітин, культивування експлантів забезпечує одночасний вплив створених умов інкубації на клітини різних типів у складі цілісного фрагмента тканини. Збереження взаємозв’язків і взаємовпливу між клітинами в експлантах максимально наближають цю модель до умов in vivo [44].
Експланти плаценти є зручним об’єктом для біологічних досліджень. Це пов’язано з порівняно легкою можливістю отримати плаценту в достатній кількості, а також етичні питання вирішуються простіше, ніж з іншими органами. Найчастіше працюють з плацентою першого та третього триместрів гестації.
В експлантах, як і у тканині плаценти, присутні клітини різного походження – від клітин епітелію до мезенхімальних (фібробласти, міофібробласти, міобласти гладеньких м`язів) та ендотеліальні клітини, клітини крові та імунної системи (клітини Хофбауера), клітини екзодермального походження (синцитіотрофоблат, цитотрофобласт) [45].
Експланти ворсинок плаценти людини використовувались in vitro для вивчення диференціації, транспорту, метаболізму та ендокринної функції плаценти. Вони можуть слугувати для досліджень функцій нормальної плаценти чи патологічних змін при захворюваннях [45,46].
Розділ 2 матеріали та методи дослідження
2.1. Об’єкт дослідження, матеріали та обладнання
Об’єкт дослідження. Ген люциферази, як екзогенний контроль для реакції Real Time PCR. Гени 18S, YWHAZ, UBC i TOP1, як референтні для нормалізації Real Time PCR в плаценті людини.
Досліджувані показники. Якість екзогенного контролю при нормалізації даних Real Time PCR, стабільність експресії референтних генів.
Використані реактиви. Під час дослідження було використано солі калію ацетат, натрію ацетат, ЕДТА (Sigma, США); кислоти борну (Helicon, Росія); спирти етанол, ізопропанол, ізоаміловий спирт (Реахім, Україна), гліцерол, фенол з буфером (рН 8,0) (Merсk, Швейцарія); хлороформ (Макрохім, Україна), гідроксид натрію (Синбіас, Україна).
Для виділення ДНК використовували такі розчини: 50 mM глюкоза, 25 mM Tris∙Cl, 10 mM EDTA, 10 M NaOH, 20% SDS, 5 M калій ацетат, крижана оцтова кислота; набір GeneJET Plasmid Miniprep Kit (MBI Fermentas, Литва).
Для очищення ДНК використовувалися: набір GeneJET PCR Purification Kit (MBI Fermentas, Литва).
Для виділення РНК використовувалися такі розчини: реагент TriZOL® (Invitrogen, США), диетилпірокарбонат (ДЕПК), інгібітор РНКаз – RiboLock RNase Inhibitor (MBIFermentas, Литва).
У роботі було використано такі ферменти: ДНКаза I (MBI Fermentas, Литва), РНКаза А ( MBI Fermentas, Литва) ендонуклеази рестрикції EcoRI , Hind III, Xba-I, Hinc II, Nco I (MBI Fermentas, Литва), зворотна транскриптаза Revert Aid M-MuLV (MBI Fermentas, Литва), T4 DNA Ligase (MBI Fermentas, Литва), SP6 RNA Poilymerase (MBI Fermentas, Литва).
Для електрофорезу було використано: агароза, вільна від РНКаз, (Gibco BRL, США),звичайна агароза, етідій бромід, TEMED (Sigma, США), буфер для внесення зразків ДНК “6х Loading Dye” (MBI Fermentas, Литва), маркер молекулярних мас ДНК “Gene ruller™ 1 kb DNA Ladder” (MBI Fermentas, Литва), РНК “2х Loading Dye” (MBI Fermentas, Литва), формальдегід (Sigma, США), буфер для електрофорезу ДНК TBE (90 мМ Тріс-НСl, 90 мМ борна кислота, 1 мМ ЕДТА, рН 8,0), буфер для електрофорезу РНК PGRB (20 mM MOPS, 2 mM AcONa, 1mM EDTA, pH 7,0); 50‑кратний буфер для електрофорезу РНК (1M MOPS, 50 мМ Na2-ЕДТА), 50-кратний буфер для форезу ДНК (0.045 М Tris, 0.01 M EDTA, борну кислоту).
Для проведення полімеразної ланцюгової реакції були використані термофільна ДНК полімераза «Taq-polymerase» (MBI Fermentas, Литва), розчин чотирьох дезоксирибонуклеозидтрифосфатів «10 mM dNTPs Mix» (MBI Fermentas, Литва).
Для реакції транскрипції використовувалися: SP6 RNA Poilymerase (MBI Fermentas, Литва), NTP Set «10 mM Mix» (MBI Fermentas, Литва), RiboLock RNase Inhibitor (MBI Fermentas, Литва), DEPC-вода.
Для культивування були використані: середовище S.O.C. (2% триптон, 0,5% екстракт дріжджів, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза), LB середовище, LB-агароза, X-Gal (MBI Fermentas, Литва), IPTG.
Матеріали та обладнання. Під час дослідження використовували обладнання, перелік якого наведено нижче:
вимірювальні прилади: спектрофотометри «Biomate 5» (Thermo Scientific, США), «NanoDrop» (NanoDrop technologies, США), pH-метр «Ионометр универсальный ЭВ-74» (СРСР), ваги електронні «AdvantureTM» (OHAUS, США);
центрифуги: настольна центрифуга «MiniSpin®» (Eppendorf, Німеччина), центрифуга з охолодженням «5804R» (Eppendorf, Німеччина), мікроцентрифуга-вортекс «FV-2400» (Biosan, Латвія);
термостати: електричний термостат сухоповітряний «ТС-80М-2» (Медлабортехніка, Україна), термоміксер модель (Biosan, Латвія), водяна баня (СРСР), термостат-струшувач «Gallenkamp Orbitalincubator» (Німеччина);
прилади для ПЛР: ампліфікатор Mastercyclerpersonal (Eppendorf, Німеччина) та прилад для ПЛР у реальному часі «IQ5» (Bio-Rad, США);
обладнання для електрофорезу: джерело живлення для електрофорезу («БП-1», СССР), камера для горизонтального електрофорезу («Helicon», США);
Програмне забезпечення. Для дизайну праймерів використовувався пакет програм Vector NTI Advence Suite 10.0 (Invitrogen, США).