Гуанінові квадриплекси днк

Вже давно було виявлено, що оліго- та полігуанінові послідовності у ДНК-ланцюгах здатні агрегувати між собою за умови присутності у середовищі інкубації одновалентних катіонів, таких як калій або натрій. Вперше такі агрегати у вигляді чотириланцюгових хеліксних молекул (квадриплексів) були виявлені Джеллертом, Ліпсетом та Дейвісом у 1962 році.

Було встановлено, що чотири ланцюги або їх ділянки поєднуються між собою за допомогою так званої гуанінової тетради, що складається з 4 гуанінів (кожен з окремого ланцюга), та формують планарну чотириланцюгову структуру, у основі якої лежать зв’язки Г-Г (слайд 9). Така доволі стабільна структура була названа G-квартетом або G-тетрадою. Тетрада включає у себе вісім водневих зв’язків, дві пари з яких нагадують класичне парування, а дві інші – парування Хугстіна, як у неправильній парі Г-Г.

Особливий інтерес до тетрад гуаніну пов’язаний, в основному, з кількісною перевагою багатих на гуанін послідовностей у більшості геномів (наприклад, у промоторах генів імуноглобулінів або на місцях рекомбінації), а, головне, з тим, що гуанінові регіони зустрічаються на кінцях еукаріотичних хромосом – теломерах.

Теломерна ДНК має тандемні повтори з коротких гуанінових шляхів з декількома залишками аденінів або/та тимінів, такі як G_nT_n, G_nT_nG_n, G_nA_n або (TTAGGG)_n, які асоційовані з хромосомними теломерними білками. У ссавців основним є останній з повторів. Функцією теломерів є захист хромосомних кінців від небажаної рекомбінації та розщеплення нуклеазами. Теломерна ДНК людини у соматичних клітинах має приблизно 8-10 кілобаз дуплексної ДНК. Одначе кінцеві 100-200 нуклеотидів на 3’-кінці знаходяться у одноланцюговому регіоні, і, в принципі, є конформаційно вільними, хоча у клітинах такі регіони асоційовані зі спеціальним білком РОТ1. Такі одно ланцюгові регіони у відсутності білку можуть згортатися та димерізуватися між собою з утворенням чотириланцюгових шпильок за допомогою описаної вище тетради гуаніну. Такі комплекси називаються квадриплексами або тетраплексами. Причому між певною кількістю гуанінів, що чергуються, може бути в принципі будь-яка комбінація нуклеотидів.

Деякі з подібних послідовностей вже використовуються для приєднання до певного діапазону клітинних білків, таких як тромбін або STAT3. Виявлено також, що певні квадриплекси мають антиракові властивості, хоча механізм їхньої дії на пухлину до кінця ще не вивчений, і. можливо, включає у себе активацію білка нуклеоліну, який відіграє певну роль у дозріванні РНК.

До сих пір невідомо, чи справді існують квадриплекси in vivo, хоча було виявлено цілу низку білків, які до них приєднуються. Одначе незаперечним залишається той факт, що формування квадриплексів можна індукувати, і не лише у теломерних регіонах. Тим більше, що була виявлена велика кількість G-трактів у багатьох регіонах геному людини, особливо, у промоторах генів – онкогенів та інших, що мають відношення до онтогенезу (наприклад, K-ras, c-kit, bcl-2, c-myc), і була доведена потенційна можливість формування квадриплексів цими послідовностями. Тому є припущення, що існування квадриплексів та індукція їх формування певними малими молекулами може бути використана для інгібування експресії відповідних генів.

Існує декілька варіантів утворення квадриплексів гуаніну в залежності від числа G-трактів:

1. Чотири ланцюги можуть асоціювати інтермолекулярно (юнімолекулярно) – слайд 10.

2. Єдиний ланцюг може згортатися внутрішньо, тоді такий варіант називається інтрамолекулярним – слайд 10а та b.

Всі ці варіанти можуть включати у себе як паралельні, так і антипаралельні ланцюги або ділянки. Для стабільності квадриплекса потрібне формування хоча б двох послідовних тетрад з гуанінів, причому тетради завжди розміщуються одна над одною у структурі, яка схожа на стекінг. Тетради мають квазіхеліксний кут закручування, який складає 36⁰, що надає багатьом з подібних ділянок вигляд розтягнутого подвійного хеліксу В-ДНК. Як правило, кількість тетрад залежить від кількості гуанінів у послідовності G-тракту, яка є зазвичай постійною, але не завжди кратна чотирьом. Наприклад, у теломерах хребетних на чотири повтори TTAGGG формується, як правило, 3 тетради.

Глікозидний кут в тетраді може бути як в анти-, так і в син-конформації, тому існує 16 можливих комбінацій, якщо приймати до уваги усі 4 нуклеотиди (слайд 10 зверху, представлено 6 з 16). Орієнтація ланцюгів по відношенню один до одного і визначає значення глікозидних кутів обертання:

1. Коли всі чотири ланцюги паралельні (як на слайді 10), всі глікозидні кути мають значення лише анти.

2. Антипаралельні квадриплекси можуть мати більшу різноманітність варіантів орієнтації в залежності від того, чи вони сформовані одним або більшою кількістю ланцюгів – анти або син для кожного з гуанілових нуклеотидів (слайди 10а та b, 11 (сформований двома ланцюгами)) та від виду контрйона.

Контрйони відіграють значну роль у підтриманні структури квадриплексів через формування йонних взаємодій з атомами О6 гуанінів тетради. Існує декілька варіантів розміщення таких йонів:

1. Йон розміщується симетрично між площинами чотирьох гуанінів тетради. Така поведінка характерна для йонів калію або амонію, які розміщуються між площинами двох сусідніх тетрад, тобто утворюють вісім координаційних зв’язків з О6 всіх восьми гуанінів (слайд 11).

2. Йон розміщується у площині тетради симетрично між чотирма гуанінами. Такий варіант підходить для малих йонів, наприклад натрію, які координуються з чотирма О6 відповідних гуанінів.

У випадку групи (стекінгу) тетрадних утворів позитивно заряджені контрйони утворюють подовжений канал, що проходить вздовж квадриплексу (слайд 12).

Послідовності між індивідуальними G-трактами у квадриплексі, як правило, формують так звані екстрахеліксні петлі. Наприклад, паралельні ланцюги, що сильно наближені один до одного, повинні мати з’єднуючу петлю, щоб поєднати нижню тетраду з верхньою, що призводить до появи так званих пропелерних петель (слайд 10b).

Квадриплекси називаються антипаралельними, якщо хоча б один з ланцюгів є антипаралельним до інших. Антипаралельними є, як правило, бімолекулярні (слайд 11) та інтрамолекулярні (слайд 10а) квадриплекси. Такі стуктури мають ще два типи петель:

1. Латеральна (крайова) петля (слайд 10а) може формуватись попарно на одному або на протилежних боках структури квадриплекса, у бімолекулярних структурах– «голова до голови» або «голова до хвоста» відповідно.

2. Діагональна петля – з’єднує протилежні ланцюги (слайд 10а), у цьому випадку самі ланцюги повинні чергувати свою паралельність.

Всі квадриплекси мають по чотири борозенки, що формуються порожнинами у районі фосфодиефірних кістяків. Причому борозенки у квадриплексах з латеральними або діагональними петлями є набагато простішими за будовою, ніж у структурах з пропелерними.

Таким чином, висока варіабельність квадриплексів пояснюється існуванням варіантів чотирьох основних параметрів:

1. Кількості тетрад,

2. Типів петель,

3. Виду та довжини послідовностей,

4. Полярності ланцюгів.

Отримані на сьогодні за допомогою кристалографії та досліджені ЯМР послідовності квадриплексів представлені у таблиці на слайді 13. Потрібно також відмітити, що останнім часом доведено існування більш складних поєднань нуклеотидів на основі квадриплексу, як, наприклад, гексада A•G•G•G•G•A (слайд 14), що утворена асоціацією двох аденінів з квартетом гуанінів.

Ще одним типом складної неканонічної квадриплексної структури ДНК є так званий і-залишок, який формується на основі пари Ц-Ц (слайд 15) у цитозин-збагачених ділянках ДНК. Причому один з цитозинів пари повинен бути додатково протонованим за позицією N3, тому така пара іноді пишеться як Ц-Ц⁺. Вперше паралельний дуплекс з парами Ц-Ц був описаний Ленгріджом та Річем у 1963 році. Відкриті насьогодні і-залишки представлені у таблиці на слайді 15.

Будова і-залишку включає у себе два паралельних дуплекси з парами Ц-Ц⁺, які інтеркалюють один в один таким чином, що сусідні пари Ц-Ц⁺ розміщені приблизно під прямим кутом одна до одної (слайд 16). І-залишок, на відміну від G-квадриплекса, має асиметричні борозенки, дві з яких є широкими (16 А) та мілкими. Дві інші мають ширину 6 А, тобто є дуже вузькими (слайд 16). Хеліксний кут закручування між парами основ набуває значення від 12⁰ до 20⁰.

Взагалі, послідовність, що відповідає і-залишку, звичайно зустрічається у дуплексній теломерній ДНК, як комплемент до послідовностей G-трактів, які здатні сформувати квадриплекс, адже ланцюг ДНК, який є комплементарним до центромерної або теломерної ДНК, повинен бути збагаченим на цитозин. За допомогою ЯМР Фаном, Гуероном та Лероєм у 2000 році була визначена структура послідовності і-залишку теломерної ділянки хромосоми людини, а також виявлена будова самого залишку, що формується за інтрамолекулярним механізмом та має у своєму складі три латеральні петлі та дві вузькі і дві широкі борозенки (слайд 17).