Інтеркаляція в днк

Багато з природних або синтезованих хімічних речовин, таких як антибіотики, антибактеріальні та анти пухлинні препарати, характеризуються наявністю у своєму складі подовжених планарних гетеро ароматичних кільцевих систем – так званих хромофорів. Як правило, така система включає у себе три таких кільця, поєднаних між собою (слайд 4), тому їх розмір приблизно дорівнює розміру звичайної пари основ. Такі речовини здатні до так званої інтеркаляції – вбудовування або введення планарного хромофору між сусідніми парами основ (слайд 6). Вперше гіпотезу інтеркаляції висловив Лерман ще у 1961 році.

У процесі інтеркаляції препарат стабілізований поляризаційними силами та Ван-дер-Ваальсовими дисперсними взаємодіями між його планарною групою та сусідніми парами основ. Оптимальною інтеркаляція виявляється, коли хромофор має один або декілька гетеро атомів, наприклад, азоту, що надає першому поляризованого характеру. Також важливою є недостатність електронів, тому більшість інтеркаляторів мають катіонну природу (приклад - акрідини).

Інтеркаляція призводить до розширення подвійного хеліксу на 3,4 А на кожну приєднану молекулу препарату, до того ж, спостерігаються зміни у хеліксному вигині – ланцюги більше розкручуються на кожному з прилягаючих до сайту інтеркаляції регіонів. Таким чином, відстань між сусідніми парами основ у районі інтеркаляції збільшується з 3,4 до 6,8 А. Максимальна кількість молекул інтрекалятора, що можуть бути увведені у дуплекс ДНК розраховується як одна на кожні три пари основ, тобто за умов максимального насичення препаратом кожен з потенційних сайтів може бути зайнятий препаратом, але обов’язково лише через одну пару основ.

Інтеркалятори вивчаються в основному через їх потенційні антиракові властивості. Деякі з таких препаратів, наприклад, антрацикліновий антибіотик доксорубіцин (адріаміцин) та його синтетичний аналог мітоксантрон, до сих пір успішно використовуються для боротьби з раком. Для даних ліків ефективність антиканцерної дії та іншої біологічної активності, як правило, корелює зі здатністю до інтеркаляції. До того ж, інтеркаляція, в основному, не залежить від послідовності, хоча у регіонах піримідин-3’-5’-пурин вона проходить трохи частіше. Одначе основною проблемою у даній області є здатність інтеркаляторів вражати не лише пухлинні, а й нормальні тканини.

Прості інтеркалятори. До них відносять речовини, які майже повністю складаються лише з хромофорної групи з позитивним зарядом, наприклад такі, як профлавін та бромистий етидій. Більш складними вважаються дауноміцин та його аналоги (той же адріаміцин) (слайд 7).

На слайді 8 представлена структура гексагонуклеотидного комплексу ДНК з інтеркалятором, представлено 2 молекули дауноміцину на кінцевих ділянках CpG послідовності d(CGTACG). Цукри у даному комплексі набувають так званої «змішаної» конформації з чергуванням С3’-ендо-3’ та 5’-С2’-ендо, що частково пояснює ефект виключення – неможливість введення інтеркалятора за сусіднім до попередньої молекули проміжком між парами основ.

Приєдання інтеркалятора до ДНК не завжди змінює всі параметри хеліксу. Наприклад, за умови вбудовування профлавіну або дауноміцину хеліксний кут закручування для двох пар основ залишається в нормі для В-ДНК і складає 36⁰, в той час як бромід етидію призводить до зменшення даного кута до 26⁰. Інтеркаляція антиракового препарату еліптіцину у дуплекс з послідовністю d(CGTACG) призводило до розкручування хеліксу до кута 21-22⁰ у місці вбудовування.

Складні інтеркалятори. Вони, окрім хромофорної групи, містять також бічні ланцюги – цукрові кільця, пептидні одиниці, тощо. Прикладом таких речовин може слугувати актиноміцин D та вже відомий нам дауноміцин. Такі бічні ланцюги після вбудовування препарату, як правило, знаходяться у регіоні малої борозенки В-ДНК, де їх розміщення стабілізується за допомогою Ван-дер-Ваальсових сил, водневих зв’язків з основами, причому такі зв’язки створюють підґрунтя для прямого, сиквенс-залежного, специфічного зчитування.

Наприклад, залишок треоніну у циклічній пентапептидній частині актиноміцину може зв’язуватися з атомами N2 та N3 гуанозину, який при цьому вимушений займати 5’-положення по відношенню до хромофору препарата, тобто послідовність у районі вбудовування повинна бути GpX. Кристалічна структура комплексу актиноміцину з ДНК з послідовністю d(GAAGCTTC), отримана Каміторі та Такусагавою у 1992 році (слайд 9), показує, що сам препарат інтеркалюється суворо у регіоні GpC, що стало підтвердженням даних ЯМР-досліджень у 1991 році.

Було також виявлено, що моноцукрові залишки дауноміцину, доксорубіцину та MAR70 (антрациклінового похідного) (слайд 9) знаходяться у регіоні малої борозенки, як було показано Темперіні з колегами у 2005 році. Такий комплекс MAR70 з дуплексом d(CGTACG) мав дві поєднані між собою цукрові групи, що були виявлені саме у даному регіоні.

Вивчення інтеркаляції антиракового глікозидного антибіотика ногаламіцину (слайд 10), дозволило виявити інший тип взаємодії бічних ланцюгів з ДНК, у даному випадку дві бічні групи були приєднані до малої та великої борозенок по одній. Причому агліконова група антибіотику тримається у малій борозенці, а аміноцукор – у великій (слайд 11), при цьому утворюються водневі зв’язки з атомами N2 та О6 гуанінів, що дозволяє говорити про пряме зчитування.

Інтеркаляція за великою борозенкою. В той час, як майже всі натуральні інтеркалюючі антибіотики та інші активні речовини розміщуюють свої бічні ланцюги у малій борозенці, як, як правило, є або цукрами, або пептидами з переважно гідрофобними зв’язками, була хімічно синтезована велика група речовин, що вводять свої групи до великої борозенки В-ДНК. Такі речовини синтезуються в основному для створення конкуренції з регуляторними білками, переважна більшість ланцюгів яких також зв’язуєтсья за місцем великої борозенки.

Одним з прикладів таких речовин є синтетичні анти ракові препарати на основі акрідину карбоксаміду. Наприклад, у 2000 році Адамсом була отримана кристалічна структура комплексу дуплексу ДНК d(CGTACG)₂ та 9-амінопохідного однієї з вихідних речовин акрідинового ряду, яка отримала назву DACA (слайд 11). У даному комплексі катіонний кінець бічного ланцюга диметиламіноетилу формує водневий зв’язок з атомами O6 та N7 залишку гуаніну зі сторони великої борозенки (слайд 12). Цікавим також є те, що такі препарати виявилися інгібіторами ДНК-топоізомерази ІІ, що, як правило, більш властиве інтеркаляторам за місцем малої борозенки, таким як антрацикліни даунорубіцин та адріаміцин.

Ще одна біс-акридинова речовина, яка також є похідною 4-карбоксаміду (слайд 12), може формувати ще один тип не ковалентних інтерхеліксних зв’язків (слайд 13), у якому кожна з двох половин ліганду інтеркалює у свій CG-сайт, який належить двом різним симметричним один до одного дуплексам, що було виявлено Хопкрофтом у 2006 році.

Деякі з інтеркаляторів можуть містити у своєму складі йони металів, бути фотоактивними, та використовуватися у якості зондів на ДНК. Наприклад, родієвий комплекс (слайд 14) був розроблений для впізнавання великої борозенки у регіоні 5’-TGCA, інтеркалюючи у сайті 5’-GC-пурин-3’, 5’-піримідин. У 2000 році Кілкопфом з колегами була отримана кристалічна структура родієвого комплексу з ДНК, де октануклеотидний дуплекс був зв’язаний одночасно з п’ятьма незалежними молекулами інтеркалятора, причому планарні групи орієнтувалися у бік великої борозенки (слайд 14), причому конформації цукрів нуклеотидів були С2’-ендо у місці зв’язування ДНК з лігандом.

Родієві комплекси можуть бути використані також для детекції неканонічних пар основ у структурі ДНК. Наприклад, П’єром, Кайзером та Бертоном у 2007 році була отримана кристалічна структура дуплексу ДНК d(CGGAAATTCCCG), до якої родієвий комплекс приєднувався в двох визначених сайтах:

1. За місцем розташування канонічної пари основ відбувалася звичайна інтеркаляція з подовженням проміжку між двома сусідніми А-Т парами до 6,8 А (слайд 15),

2. За місцем розташування двох неканонічних пар А-Ц введення ліганду призводить до витіснення відповідних основ аденозину та цитидину у малу та велику борозенки відповідно.

Ще один незвичайний інтеркаляційний комплекс був виявлений за місцем гексамерної послідовності d(CGTACG) з акридином-4-карбоксамідом, біс-акрідином, та синтетичним аналогом дауноміцину – аметантроном. Замість класичної інтеркаляції за великою борозенкою, утворювалася так звана інтеркаляційна «платформа» з чотирьох дуплексів, причому термінальні кожного ланцюга вбудовувалися у сусідній з формуванням пари Ц-Г у симетричному дуплексі. Така структура, сформована псевдоінтеркаляційно, дуже нагадувала четвертинне сполучення у квадриплексі ДНК, про який ми вже говорили. Комплекс схожої будови існує у випадку введення у ДНк планарної молекули псоралену.

Ще одними цікавими інтеркаляторами є порфірини, такі як тетра-N-метилпіридилпорфірин (TMPyP4) (слайд 15, де Х – нікель, мідь або цинк). Такий ліганд інтеркалює у В-ДНК так, що кожна з двох його сусідніх бічних N-метил-піридильних груп входить у кожну з борозенок, причому у малій відбувається формування зв’язків з парами А-Т, а у великій – інтеркаляція між Г-Ц. Одначе можливі варіанти неповної інтеркаляції – так, комплекс з дуплексу ДНК d(CGATCG)₂ та мідь-порфірином є напівінтеркалюючим – введення бічних груп відбувається лише за двома термінальними сайтами CpG, причому кожен з цитозинів витісняється з хеліксу (слайд 16). Такий же нікелевий комплекс формує іншу структуру, що було показано Беннетом у 2000 році – на гексануклеотиді ДНК з послідновістю d(CCTAGG)₂ молекула порфірину не інтекалюється, а, скоріше, стекінгує на кінцях псевдо-додекануклеотиду, що сформований двома гексануклеотидними дуплексами, які поєднані між собою за принципом «кінець до кінця» (слайд 16). Причому, один з таких додекануклеотидних дуплексів позиціонований з порфіриновою молекулою на одному з кінців, та одночасно розміщений навпроти розширеної малої борозенки іншого дуплекса.

Біс-інтеркалятори. До таких відносяться молекули препаратів ехіноміцину та тріостину А, що також є антираковими ліками (слайд 17) та мають одразу дві інтеркалюючі хромофорні групи, які поєднані між собою циклічними олігопептидами. Подібні препарати інтеркалюють таким чином, що два хромофори, чиї площини розділені проміжком у 10,2 А, можуть одночасно приєднуватись до сайтів на ДНК, які розділені однією парою основ (слайд 17). Такий спосіб вбудовування називається біс-інтеркаляцією та призводить до вдвічі більшого розкручування ДНК, ніж у випадку моно-інтеркаляції.

Наприклад, ехіноміцин є однією з таких речовин, для приєднання до ДНК він потребує динуклеотиду 5’-CpG, за місцем якого інтеркалюється між двома парами Ц-Г за допомогою двох квіноксалінових хромофорів. Пептидна частина даної молекули знаходиться у малій борозенці, причому утворює водневі зв’язки з аміногрупою у другому положенні гуаніну. Незвичайним у цій структурі є формування водневих зв’язків за Хугстіном для пар основ які з обох зовнішніх боків прилягають до введених кілець, хоча дві пари основ між хромофорами зберігають класичну геометрію водневих зв’язків (слайд 18, на прикладі двох молекул тріостину). Одначе, формування таких неканонічних пар не є обов’язковим, і, як правило, залежить від довжини послідовності.

Були також розроблені синтетичні аналоги біс-інтеркаляторів на основі дауноміцину, оскільки такі речовини через зразу два хромофори дуже міцно зв’язуються з ДНК (набагато міцніше у порівнянні з дауноміцином) і, можливо, матимуть підвищену біологічну активність, тому що здатність до інтекаляції, як уже було сказано, позитивно корелює з цитотоксичністю та антираковою активністю. Однією з таких молекул виявився так званий WP631, який являє собою два хромофори дауноміцину з лінкерними групами р-ксилену, що поєднані через екзоциклічні аміногрупи на кожному з додаткових цукрових кілець(слайд 18). Був отриманий комплекс даної речовини з гексануклеотидом ДНК d(CGTACG), який мав незвичайну афінність – близько 10¹¹ моль^-1, яка співвідноситься з афінністю багатьох регуляторних білків (слайд 19). Одначе анти ракова активність такого препарату виявилась не настільки перевищуючою реальний дауноміцин. До того ж, WP631 має високу токсичність до нормальних клітин та не може специфічно направлятись на онкогени.

Варіант біс-інтеркаляції через велику борозенку достатньо нерозповсюджений. Він був спостережений, в основному, для біс-акрідинів (Хопкрофт, 2006 рік) та синтетичних препаратах, що містили два пірокарбазольних кільця, поєднаних між собою гнучким аліфатичним ланцюгом (Пік, 1994 рік). Кожна з планарних груп такої молекули, за умови приєднання до послідовності d(CGCG), інтеркалюється на ділянці CpG, причому лінкер розміщується якраз у великій борозенці. Такий комплекс також характеризується згином ДНК у бік малої борозенки.

На слайді 20 у таблиці представлені відомості про отримані насьогодні кристалічні комплекси ДНК з різноманітними інтеркаляторами.