Сиквенс послідовностей рнк

Використання зворотної транскриптази. Одним з шляхів визначення послідовності РНК є початкове перетворення її на ДНК. Воно може здійснюватись зворотною транскриптазою – ДНК-полімеразою, яка використовує одно- або подвійно-ланцюгові ДНК чи РНК у якості матриці. Таким чином, через ДНК для сиквенсу РНК можна застосувати, наприклад, вже розглянутий метод Сенгера.

Хімічний сиквенс РНК за методом Петі. Цей метод був адаптований Петі для РНК з вже відомого нам методу Максама-Гілберта. Замість піперидину використовується анілін (рН = 4,6), який розриває ланцюг РНК у специфічному для кожного з модифікованих нуклеотидів місці, оскільки РНК є занадто чутливою до основного гідролізу, щоб використовувати піперидин.

Механізм реакції дуже схожий з уже розглянутим, каталізованим піперидином. Одначе, друга стадія β-елімінації взагалі не відбувається. Таким чином, розщеплення аніліном дає 5’-фосфат та гетерогенний 3’-кінець, отже, для сиквенсу використовується 3’-мічені ланцюги РНК.

Осново-специфічні хімічні реакції є схожими з прийнятими для ДНК, лише з заміною піперидину на анілін та з використанням 3М NaCl для У-специфічної реакції:

1. Для Г диметилсульфат + анілін,

2. Для У гідразин + анілін,

3. Для С + У гідразин + 3М NaCl + анілін,

4. Для А + Г діетилпірокарбонат + анілін.

Схема дії диетилпірокарбонату та інших алкілюючих агентів на основи представлена на слайді 10. Реакція з диетилпірокарбонатом заміщує стадію депуринізації в сиквенсі ДНК. Загалом депуринізація та депіримідинізація в РНК відбуваються в 100-1000 разів повільніше, ніж у ДНК.

Сиквенс РНК за допомогою рибонуклеази. Рибонуклеази є дуже ефективними інструментами у сиквенсі РНК. Для коротких олігонуклеотидів часткове розщеплення ендонуклеазами може бути достатнім для визначення усієї послідовності. Такі осново-специфічні рибонуклеази, відомі насьогодні, представлені у таблиці на слайді 5.

Найчастіше використовують такі рибонуклеази, що розщеплюють послідовність, залишаючи на 3’-кінці певний нуклеотид. Таким чином, на 3’-кінці продукту може бути або 2’-3’-циклічний фосфат, або 2’-фосфат чи 3’-фосфат.

Для визначення послідовності, мічені за одним з кінців РНК частково гідролізують осново-специфічними рибонуклеазами, представленими у таблиці. Отримані фрагменти піддають електрофорезу. Порівняння результатів для визначення послідовності проводять з залученням продуктів гідролізу (драбинки), отриманих за допомогою використання гідроксидного йону. Даний механізм ОН-гідролізу не є осново-специфічним, але також дає 3’-фосфати. Основою для сиквенсу і порівняння є той факт, що, навідміну від рибонуклеазного гідролізу, який не відбувається у місцях розміщення деяких модифікованих нуклеотидів, гідроліз за допомогою ОН^- відбувається після кожного з нуклеотидів.

Повне розщеплення молекул РНК осново-специфічними рибонуклеазами також може використовуватися для характеристики їх послідовностей. Наприклад, за однією з методик дві або більше таких нуклеаз використовуються для повного гідролізу РНК. Далі фрагменти з кожної реакції розділяються у двох вимірах, наприклад, за допомогою паперового електрофорезу у першому вимірі, та ТШХ – у другому. Такий так званий метод «фінгерпрінтингу» дозволяє локалізувати майже всі модифіковані нуклеотиди, включаючи розгалужені рибозні залишки, поєднані через 2’- та 3’-положення; даний метод особливо ефективний для характеристики невеликих кількостей природної РНК.