10 Блок

1. Задача и методология генетической инженерии.

Генная инженерия - исследования в генетике для получения организмов с новыми комбинациями наследственных свойств. В основе лежит целенаправленное манипулирование нуклеиновых кислот. Основоположники - Уотсон и Крик ( 1953 год). Основные открытия:

-Была открыта двойная структура ДНК и постулирован её матричный синтез.

- Транскрипция.

- репликация

- трансляция

- появление нового экспериментального инструмента –рестриктационных эндонуклеаз.

- Был открыт путь для широкомасштабного получения генных продуктов

Условия, которым должен соответствовать ген человека, что бы получить полную характеристику его структуры:

1) соответствующие фрагменты ДНК должны быть идентифицированы однозначно.

2) они должны быть выделены и накоплены в количестве, должностном для биохимического анализа.

3) должна быть определена вся нуклеотидная последовательность.

2. Рестриктазы и их использование.

Рестриктазы - это ферменты, узнающие и атакующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК.

Они обладают способностью «разрезать» двойную спираль ДНК. Условия такого разрезания -определенная последовательность нуклеотидов (сайт узнавания).

В 1953 году было обнаружено, что ДНК определенного штамма E. coli, введенная в клетки другого штамма не проявляет генетической активности, так как быстро расщепляется на мелкие фрагменты. Это явление связано со специфической модификацией хозяйской ДНК - она содержит несколько метилированных оснований, отсутствующих в немодифицированной ДНК. Бактерия способна отличить свою собственную ДНК от любой вторгающейся «чужеродной» именно по типу ее модификации. За «метку» отвечают метилирующие ферменты - ДНК-метилазы. Различие в модификации делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестрицирующих ферментов, которые узнают отсутствие метильных групп в соответствующих сайтах. Рестриктаза, была выделена в 1968 г. Мезельсоном и Юанем.

Сущ 3 класса рестриктаз: -1 класса

- 2 класса (узнают посл-ть нуклеотидов, делают двуцепочечные надрезы)

- 3 класса

3. Понятие о векторах.

"вектор" - это молекула нуклеиновой кислоты, способная после введения в клетку к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов репликации и транскрипции.  Векторные молекулы должны обладать следующими свой­ствами:  1) способностью автономно реплицироваться в клетке-реципиенте. 2) содержать один или несколько маркерных генов, благодаря экспрессии которых у клетки-реципиента появляются новые призна­ки, позволяющие отличить трансформированные клетки от исходных;  3) содержать по одному или два участка (сайта) для различных рестриктаз в разных районах. В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить на две группы:

1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена;

2) специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов (обеспечивают синтез белковых продуктов клонированных генов). -В качестве прокариотических векторов используются плазмиды, бактериофаги;

-В качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений, Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках. Большинство плазмидных векторов получено на основе природных плазмид ColE1, pMB1 и p15A. Их делят на два класса:

1) способные сами переходить из клетки в клетку;

2) не способные переходить. 4. Задачи клеточной инженерии.

Клеточная инженерия –  методика конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции. Культивирование клеток – это метод сохранения жизнеспособности клеток вне организма  в искусственно созданных условиях.    Задачи  клеточной инженерии: 1)получение и применение культур клеток животных, человека, растений и бактерий для культивирования вирусов с целью создания вакцин, сывороток, диагностических препаратов. 2) культивирование культур клеток для получения биологически активных веществ. 3)получение моноклональных антител (гибридом) для использования в медицине и ветеринарии. 4)генно-инженерные манипуляции с клетками для получения новых форм, новых культур клеток, биопрепаратов и др.     Задачи   генной   инженерии. Это совокупности методов, позволяющих переносить   генетическую   информацию из одного организма в другой. Цель   генной   инженерии - получение клеток,   способных      нарабатывать некоторые     «человеческие»     белки. Так,  с   1980  г.  гормон  роста  человека - соматотропин   получают   из бактерии Е. coli (кишечной палочки). Его  недостаток приводит   к   карликовости.   До развития генной инженерии его выделяли из гипофизов от трупов. Соматотропин, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободны от вирусных загрязнений.   5.Слияние протопластов. Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов - метод гибридизации называемый соматическим. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при соматической гибридизации используются диплоидные клетки растений. Техника соматической гибридизации может позволить:

• скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов),

• получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого,

• слияние трех и более клеток,

• получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей,

• перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение,

• получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.

Осматическая гибридизация важна для анализа  как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков - скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т. д.

Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических:

1. При физическом способе слияния протопластов, разработанном Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 году, протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем.

2. При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния - АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ.

3. Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного растения с помощью разных флуоресцентных красителей.

Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количестве. Многоядерные продукты слияния разрушаются. Первое сообщение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось в 1972 году (Карлсон), в нашей стране подобное осуществили в лаборатории Бутенко Р.Г. в 1975 году.

Судьба геномов после слияния протопластов может быть различной:

1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии сегрегируют в процессе клеточных делений.

2. Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов.

3. Возникновение гибридных клеток и растений в результате слияния более чем двух родительских клеток.

Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид - продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид - растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. При слиянии могут образовываться и так называемые асимметричные гибриды – продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут быть выращены растения – регенеранты.