Методика проведения лабораторной работы Работа № 1. Диализ

Принцип метода. Диализ – это процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент, почечные фильтры капсулы Боумена - Шумлянского). Обладая большим диаметром и молекулярной массой, белковые молекулы не способны проникать через мелкие поры, в то время как низкомолекулярные вещества и ионы легко диффундируют через мембраны в окружающую среду.

Порядок выполнения работы: в целлофановый мешочек (диализатор) наливают на 1/3 объема раствор яичного белка, содержащий Nacl (диализируемая жидкость). Диализатор подвешивают на стеклянных палочках и погружают в стакан с дистиллированной водой (диализат). Через 1 час от начала диализа с небольшими порциями диализата и диализируемой жидкости, отобранными с помощью пипетки, проводят пробы на Nacl (хлориды) и белок.

Проба на хлориды: 10 капель исследуемой жидкости + 1 капля 10% раствора HNO₃ + 1 капля 1% раствора AgNO₃ → наблюдается образование белого творожистого осадка

Проба на белок

(биуретовая реакция)

10 капель исследуемой жидкости + 5 капель 10% раствора NaOH + 1 капля 1% раствора CuSO₄ → при наличии белка в растворе проба дает фиолетовое окрашивание, при отсутствии - голубое

Отметить результаты на белок и хлориды с содержимым диализатора и наружной жидкостью. В выводе указать, почему белки не диффундируют через полупроницаемые мембраны.

Клинико-диагностическое значение. Особый вид диализа (гемодиализ) применяется в клинике для очистки крови с целью удаления из нее низкомолекулярных токсических веществ (аппарат «искусственная почка»)

Работа №2. Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания

Принцип метода. Высаливание – обратимая реакция осаждения белков из растворов с помощью больших концентраций нейтральных солей: Nacl, (NH₄)₂SO₄ и др. При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка. На процесс высаливания влияет ряд факторов: молекулярная масса, заряд, гидрофильность белка, в связи с чем для осаждения требуется различная концентрация одних и тех же солей. Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, осаждаются в полунасыщенном растворе Nacl, а альбумины – в насыщенном. Высаливание белков является обратимой реакцией, т.к. осадок белка может вновь растворяться после удаления Nacl, например, с помощью диализа.

Порядок выполнения работы:

1). К 40 каплям раствора яичного белка добавляем Nacl (кристаллический) до насыщения → выпадает белый аморфный осадок глобулинов.

Через 10 минут (время полного осаждения глобулинов) осадок отфильтровывают.

2). Пробирку с фильтратом, содержащим альбумин, кипятят несколько минут. Наблюдается необратимое осаждение альбуминов, вызванное денатурацией белка и потерей растворимости. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают.

3). С конечным фильтратом проделывают биуретовую реакцию (см. Диализ). В отсутствии белка в фильтрате от альбуминов убеждаются по отрицательным результатам биуретовой реакции. Для сравнения проделать биуретовую реакцию с исходным раствором яичного белка.

Отметить результаты биуретовой реакции. В выводах указать, какая из белковых фракций легче осаждается и причины этого явления.

Клинико-диагностическое значение. Метод используется для фракционирования белков (разделения белков по фракциям), что позволяет использовать отдельные белковые фракции крови с лечебными целями (альбумин, γ-глобулины, фибриноген плазмы крови и др.)