Иммуноферментный метод (ифм)

Метод разработан в 70-х годах шведскими учёными Энгвал-лом и Перлманном, голландскими учёными Ван Вееменом и Шууром и американскими исследователями под руководством Рубинстайна.

Метод широко используются в лабораторной клинической иммунологии для диагностики инфекционной патологии, вклю­чая ВИЧ-инфекцию, дефектов гуморального и клеточного звень­ев иммунной системы, в аутоиммунной патологии и в массовых эпидемиологических исследованиях.

В силу чрезвычайно мощной каталитической активности ферменты наиболее чувствительны и универсальны в качестве метки. В качестве ферментов-маркеров используются щелочная фосфатаза, ацетилхолинэстераза, бетта-галактозидаза, пероксида-за хрена и т.д. Каталитическая активность ферментов различна и зависит от его конформационных свойств. Большинство исполь­зуемых ферментов за 1 мин. при обычной температуре способны превращать в компоненты 10 молекул субстрата в расчете на од­ну молекулу фермента.

Иммунопероксидазные методы наиболее просты и эффек­тивны при анализе срезов тканей, обнаружении антигенов после электрофоретического разделения. Введение в систему МкАт по­вышает специфичность ИФА.

Существует множество модификаций метода ИФА, но наи­более известным и используемым в практике является гетеро­генный ИФА. В качестве «твердой фазы» используют полисти­рол, полиэтилен, сефадекс, акриламид, целлюлозу, бумажный диск и др.

Среди гетерогенных методов различают конкурентный, неконкурентный, «сэндвич» (англ, sandwich — бутерброд), ингибиторный прямой и непрямой.

В последнее время выпускаются тест-системы, где в качестве твердой фазы используются различные материалы: бумажные диски, бусинки, парамагнитные частицы и др.

Чувствительность ИФА высокая.Специфичность определяется чистотой антител, используе­мых в системе.

Иммунологический лигандный метод применяется в двух ва­риантах: конкурентный, неконкурентный.

Твердофазный вариант метода наиболее популярен, так как упрощает разделение свободных и связанных компонентов реак­ции.

При иммуноферментном твердофазном варианте метода осуществляют выявление антигенов или антител с помощью со­ответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой).После соединения антигена с меченной ферментом иммун­ной сывороткой в смесь добавляю! субстрат пероксидазы - пере­кись водорода.

Субстрат расщепляется ферментом, что в конечном итоге приводит изменению цвета продукта реакции: интенсивность ок­раски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компо­нентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшеток из полистирола.

Конкурентный твердофазный ифа

При наличии в исследуемой сыворотке специфических анти­тел происходит их связывание с антигеном на твёрдой фазе, суб­страте, в результате чего специфичные антитела, меченные фер­ментом, не взаимодействуют со связанным антигеном - отмеча­ется низкое содержание маркёра.

При отсутствии специфических антител в исследуемой сыво­ротке, иммунного комплекса антиген-антитело не образуется, а так как антиген, находящийся на твёрдом субстрате, не связался, то спе­цифические антитела, меченные ферментом, взаимодействуют с ним, в результате чего определяют высокое содержание маркёра.