Иммунофлюоресцентный метод

Ре­акция иммунофлюоресценции — РИФ (метод Кунса) основана на том, что антигены тканей или микроорганиз­мы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, ме­ченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах лю­минесцентного микроскопа (прямой метод). Бактерии в мазке, обработанные такой специфической сывороткой, светятся по пе­риферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой, непрямой с комплементом.

И ммунофлюоресцентный метод чаще применяется для ка­чественной характеристики биоматериала с целью обнаружения конкретного микроорганизма, конкретной клетки. Метод имму-нофлюоресценщш может проводиться в прямом и непрямом ва­риантах. Для обнаружения искомого вещества используется лю­минесцентный микроскоп.

В качестве флюоресцентной метки используют красители: изотиоцианат (сине-зеленый), родаминсульфохлорид (оранжево-красный) и др.

При прямом флюоресцентном методе Кунса специфиче­ские флюоресцирующие антитела взаимодействуют с гомологич­ными антигенами микроорганизмов, в результате образуются иммунные комплексы антиген-антитело и при люминесцентной микроскопии регистрируют свечение. Недостаток метода - при­готовление флюоресцирующих специфических антител против каждого выявляемого антигена.

Непрямой метод имеет преимущество не только в более вы­сокой чувствительности, но и в отсутствии необходимости полу­чать меченые антисыворотки различной специфичности.

Специфические немеченые антитела связываются с антиге­ном и выявляются с помощью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов вида, которому принадлежат специфические данному антигену антитела.

Свечение, выявляемое при люминесцентной микроскопии, обусловлено фиксацией флюоресцирующих антиглобулиновых антител на иммунном комплексе антиген-специфическое антите­ло.

Постановка реакции.

На специальном предметном стекле готовят мазок из иссле­дуемого материала, обрабатывают иммунной кроличьей сыво­роткой, стёкла помещают во влажную камеру, инкубируют в те­чение 15 мин. при температуре 37 С, промывают препарат и на­носят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов кролика, инкубируют в термостате и промы­вают препарат.

Метод иммунофлюоресценции используется в лабораторной диагностике для обнаружения специфических антинуклеарных антител, характеристики их расположения; определения популя­ций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток.

Иммунофлюоресцентные методы широко используются для обнаружения аутоантител и антител к тканевым и клеточным ан­тигенам. Используя срезы тканей (содержащих большое число антигенов), на одном предметном стекле можно выявить антите­ла к нескольким разным антигенам, установив при этом их внут­ритканевое (клеточное) или внутриклеточное распределение.

РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфиче­скими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакцион­но-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со сво­бодными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ-АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микро­скопом (рис 48). С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериаль­ных и вирусных антигенов. Метод РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой ме­тод.

Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым антите­лом. Непрямой метод - на поэтапном выявлении комплекса АГ-АТ с помощью флуоресцент­ных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенно­го антигена со специфическими антителами. Второй этап - в выявлении этого комплекса пу­тем обработки его меченым антигаммаглобулином.

Преимущество РИФ - простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп.