Ртга с целью проведения серологической диагностики

При использовании РТГА с целью проведения серологиче­ской диагностики вирусных инфекционных заболеваний, берут парные сыворотки пациента, первую сыворотку получают в на­чале заболевания, вторую - спустя 2 недели и более.

Диагностическое значение имеет возрастание титра антител в 4 раза и более, что свидетельствует о положительной серологи­ческой диагностике вирусного инфекционного заболевания.

Для проведения серологической диагностики в РТГА в лун­ках планшета готовят двукратные разведения исследуемых сы­вороток пациента в изотоническом растворе хлорида натрия по 0,25 мл. Предварительно определяют титр вирусного антигена в реакции гемагглютинации с целью выбора рабочей дозы. Рабочее разведение берут в 16 раз меньше титра. К разведениям сыво­ротки добавляют по 0,25 мл рабочего разведения антигена, инку­бируют 2 часа при температуре 37°С и добавляют по 0,5 мл 1% взвеси куриных эритроцитов. После инкубирования в течение 2 часов регистрируют результат реакции. В положительном случае на дне лунки образуется плотный осадок эритроцитов в виде дис­ка с ровными краями. Устанавливают титр антител по последнему разведению сыворотки при котором отмечается поло­жительный: результат реакции, подавляется гемагглютини-рунлная активность антигена.

В РТГА ставят три контроля: I) контроль эритроцитов (0,5мл изотонического раствора хлорида натрия +0,5 мл использован­ной взвеси эритроцитов; 2) контроль используемой сыворотки на способность агглютинировать эритроциты (0,25 мл исходного разведения сыворотки + 0,25 мл изотонического раствора хлори­да натрия +0,5 мл взвеси эритроцитов); 3) контроль специфично­сти антигена (при ретроспективной диагностике инфекций) со стандартной иммунной сывороткой (0,25 мл иммунной сыворот­ки в разведении 1:10 + 0,25 мл рабочего разведения антигена + 0,5 мл взвеси эритроцитов. Широко применяется для диагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антител и для идентификации многих вирусов по их антигенам.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ

Используются как с диагностической целью (выявление антител в сыворотке крови), так и с целью идентификации (определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизма)

В реакции нейтрализации участвуют 3 компонента:

1. Вирус;

2. Сыворотка, содержащая антитела;

3. Биологический объект

Постановка реакции нейтрализации на лабораторных животных

Пробирки расставляют в штативы параллельными рядами так, чтобы количество пробирок в каждом ряду соответствовало числу используемых в опыте разведении вируса (последнее должно превышать биологический титр вируса), а количество ря­дов — числу взятых сывороток и контролен. Для контроля в один ряд пробирок наливают нормальную сыворотку, в другой — изо­тонический раствор хлорида натрия (контроль активности виру­са). Ингредиенты вносят в пробирки в объеме 0,5 мл. Сыворотки используют неразведёнными или в разведении 1:5. Готовят раз­ведения вирусной суспензии, которые вносят в пробирки, содер­жащие в равном объеме специфические сыворотки, нормальную сыворотку или изотонический раствор хлорида натрия. Смеси встряхивают, выдерживают в течение 1—2 часа при температуре термостата, комнатной температуре или 18—20 ч при 4°С и вво­дят для индикации инфекционного вируса лабораторным живот­ным. Каждой смесью в равном объеме заражают по 4—6 лабора­торных животных.

Критерием наличия инфекционного вируса в смеси служит гибель лабораторных животных. При оценке результатов высчи­тывают по методу Рида-Менча предельное разведение вирусной суспензии, которое вызвало гибель 50% зараженных животных. Для каждой взятой в опыт иммунной сыворотки высчитывают индекс нейтрализации, т. е. максимальное количество ле­тальных доз вируса, нейтрализованное данной иммунной сы­вороткой по сравнению с контрольной сывороткой. Тип ви­руса устанавливают по типоспецифической сыворотке, которая показала наивысший индекс нейтрализации.

Постановка реакции нейтрализации в развивающихся куриных эмбрионах

Критерием наличия инфекционного вируса в смеси его с сы­вороткой при использовании в качестве индикаторной системы куриных эмбрионов является выявление морфологических изме­нений на хорион-аллантоисных оболочках или гемагглютинина в аллантоисной жидкости эмбрионов. При оценке результатов по методу Рида-Менча для куриных эмбрионов определяют — одну ИД₅о.

Реакция нейтрализации по методу цветной пробы.

Цветная проба основана на способности вирусов изменять метаболическую активность зараженных клеток, что определяют по цвету индикатора, содержащегося в среде. В незараженных культурах клеток под влиянием выделяющихся продуктов кле­точного метаболизма рН среды сдвигается в кислую сторону, вы­зывая изменение цвета фенолового красного. В зараженных куль­турах в результате дегенерации клеток их метаболическая актив­ность подавляется, и цвет фенолового красного не изменяется или изменяется частично. Специфические иммунные сыворотки, нейтрализуя вирус, предотвращают угнетение метаболизма кле­ток.

Сущность реакции вирусной нейтрализации в культуре кле­ток.

Специфические антитела прочно соединяются с вирусной частицей, в результате взаимодействия между вирусом и антите­лом происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант, ответственных за соединение вирусной частицы с чувствительными клетками. В результате указанного взаимодействия вирус утрачивает способ­ность размножаться в чувствительной к нему биосистеме. В качестве чувствительной биосистемы могут выступать культура клеток, куриный эмбрион, организм чувствительного лабораторного животного.

Перед постановкой реакции готовят вируссодержащую сус­пензию из выделенного возбудителя или из известного лабора­торного штамма {при проведении титрования сывороток). В зави­симости от вида вируса его выращивают в культуре ткани, в ор­ганах лабораторных животных, в курином эмбрионе. Для реакции нейтрализации пользуются культуральные жидкости, суспензии органов лабораторных животных, аллантоисную и амниотиче-скую жидкости куриных эмбрионов.

В зависимости от целей исследования реакция вирусной ней­трализации может ставиться в 2 направлениях:

1. для идентификации вируса.

1. для проведения серологической диагностики вирусных ин­фекционных заболеваний.

Перед постановкой каждого нейтрализационного опыта ви­рус предварительно титруют, определяя его конечное разведение, вызывающее повреждение культуры ткани или инфицирование лабораторных животных, куриных эмбрионов.

Методика подготовки реакции.

Клетки выращивают обычным способом в матрацах до обра­зования сплошного монослоя. Затем их снимают со стекла версе-ном, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин 5—10 мин, ресуспендируют в питательной среде, контролируют на стериль­ность

Титрование вирусов в цветной реакции. Готовят 10-кратные разведения вирусной суспензии на питательной среде, содержа­щей 2% бычьей сыворотки. Каждое разведение вируса вносят в объеме 0,25 мл в 2 пробирки. К ним добавляют по одной дозе клеток в объеме 0,25 мл, 0,25 мл питательной среды и 0,6—0,8 мл вазелинового масла.

В пробирках, содержащих вирус, клетки дегенерируют и цвет среды не изменяется или меняется лишь частично: остается красным или оранжевым. Желтый цвет среды в пробирках свидетель­ствует об отсутствии вируса и наличии живых клеток.

Результаты реакции оценивают по методу Рида — Менча, ус­танавливая то наибольшее разведение вирусной суспензии, кото­рое подавило метаболизм в 50% зараженных пробирок (среда со­хранила красный или оранжевый цвет), и принимая его за одну ЦПД₅о.

Реакция нейтрализации для идентификации вируса

Различные разведения вируссодержащего материала смеши­вают с неразведённой противовирусной сывороткой. Смесь ком­понентов инкубируют в термостате при температуре 37 ⁰С в те­чение 1-2 часов или при температуре 4°С в течение 18 часов. Смесью вируса и сыворотки заражают культуру клеток. При ре­гистрации реакции определяют нейтрализующий эффект антител сыворотки по отсутствию цитопатического действия вируса на клетки. Тип выделенного вируса соответствует типу иммунной сыворотки, предупредившей развитие специфической дегенера­ции клеток.

Титрование антител в цветной реакции.

При проведении серологической диагностики вирусных ин­фекций с помощью реакции нейтрализации определяют динами­ку нарастания титра вируснейтрализующих антител по извест­ному вирусу. Для этого пользуются парными сыворотками, взя­тыми от больного в разные сроки - в начале и в конце заболева­ния, диагностическое значение имеет 4 кратное и более возраста­ние титра антител, регистрируемое в ходе заболевания.

Готовят двукратно возрастающие разведения используемой сыворотки, каждое из которых в объеме 0,25 мл вносят в про­бирки параллельных рядов, количество которых соответствует числу взятых в опыт серологических типов вирусов. Во все про­бирки добавляют по 0,25 мл вирусной суспензии, содержащей 100 ЦПД₅о. Смеси инкубируют 1 ч при комнатной температуре, добавляют по 0,25 мл суспензии клеток, термостатируют при 37°С. Опыт сопровождают тремя контролями: 1) контроль кле­ток; 2) контроль токсичности используемой сыворотки; 3) кон­троль дозы вируса

Пробирки инкубируют в термостате в течение 6—7 дней и оценивают результаты, ориентируясь на состояние контролен клеточных суспензий.

В пробирках, содержащих полиостью нейтрализованный ан­тителами вирус, метаболизм клеток не нарушается и цвет среды становится желтым. При частичной нейтрализации вируса анти­телами часть клеток остается живой, и среда приобретает оран­жевый цвет. При отсутствии антител вирус вызывает дегенера­цию клеток, метаболическая активность их подавляется и среда остается красной.

За титр антител принимают то предельное разведение сыво­ротки, которое нейтрализует действие 100 ЦПД₅₀ вируса и пре­дотвращает угнетение метаболической активности клеток (жел­тый цвет среды).